2018年医疗行业树突状细胞的培养研究报告.pptx

2018年医疗行业树突状细胞的培养研究报告,2018/1/24,2,研究背景研究进展研究的目的与意义技术路线预期结果,3,2018/1/2研究背景,1973年Stdnman和Cohn在小鼠脾脏发现具有树枝状突起的独特形态的贴壁细胞，并命名为树突状细胞（dendritic cell，DC）。DC是目前所知抗原提呈功能最强的APC。最大的特点是未成熟的DC具有强大的捕获抗原的能力，成熟的DC能够刺激初始型T细胞（naitveT cell）活化与增殖。而M、B细胞等仅能刺激已活化的的T细胞或记忆性T细胞，因此DC是特异性免疫应答的始动者。,2018/1/24,4,2018/1/24,5,DC作为免疫反应中的“哨兵”，它广泛分布于脑及睾丸以外的全身各脏器，进行“通报敌情”和“发动战争”。,6,2018/1/24研究背景,DC起源于造血干细胞（HSC）。根据分化来源途径:髓样树突细胞（MDC，DC1）和淋巴样树突细胞（LDC，pDC，DC2）。MDC与单核细胞、粒细胞有共同的前体细胞。LDC与T细胞、NK细胞有共同的前体细胞。来源于骨髓或胸腺的MDC和LDC均为未成熟DC,未成熟DC摄取抗原后发生迁移.通过输人淋巴管进入局部淋巴结，并分化为成熟DC，提呈抗原激发T细胞免疫应答口。未成熟DC低表达MHCll类分子、共刺激分子和粘附分子，高表达FcR、CR及TLR、MR(甘露搪受体）等。,2018/1/24,7,8,2018/1/24研究背景,未成熟的DC能通过吞噬和巨胞饮作用摄取杭原，但加工提呈抗原的能力较弱，主要分泌TNF- , IL-1 , IL6等细胞因子。未成熟DC一但摄取抗原或受到炎性刺激(如LPS, TNF- ）即进入成熟阶段。成熟的DC表型和功能均发生改变:高表达MHCll类分子、共刺激分子和粘附分子(如ICAM一1、DC-SIGN）.不表达FcR、CR和病原体受体。虽然摄取和加上抗原的能力降低，却具有强大的提呈抗原能力。主要分泌IL-4、IL-12等细胞因子。,2018/1/24,9,2018/1/24,10,11,2018/1/24研究背景,在体内迁移是DC的重要特征。这与其趋化因子受体表达谱有关。未成熟DC,表达CCR1、CCR2、CCR5、CXCR1和CXCR2。成熟DC表达CCR7和CXCR4，使其能针对不同趋化因子发生反应。迁移到不同部位产生不同作用。,2018/1/24,12,研究背景,DC前体细胞在骨,髓产生，经外周血进入全身各组织，发育为未成熟的DC。未成熟的DC通过吞饮、内吞、吞噬三种方式摄取抗原， 其表面受体的表达、细胞因子的分泌、形态等发生变化，逐渐迁移到淋巴器官并成熟。,2018/1/24,13,研究背景,未成熟DC摄取抗原后发生迁移.通过输入淋巴管进入局部淋巴结，并分化为成熟,DC，提呈抗原激发T细胞免疫应答。,2018/1/24,14,DC的意义,DC对外源性和内源性抗原的通过不同途径进行加工，提呈给CD4+或CD8+初始T淋巴细胞，控制着初始T淋巴细胞的命运。DC还可以分泌一些细胞因子，同时促进初始T淋巴细胞的活化、增殖和发育。,CD4+初始T淋巴细胞通过三种信号（TCR信号、共刺激信号、细胞因子）活化并分化成熟为有功能的效应性辅助性Th细胞。,2018/1/24,15,2018/1/24,16,2018/1/24,17,2018/1/24,18,2018/1/24,19,DC不仅可以激发初始T淋巴细胞，而且还直接或间接参与B淋巴细胞、自然杀伤细胞等的免疫应答过程中。DC是天然免疫与获得性免疫连接的桥梁。,2018/1/24,20,2018/1/24,21,22,2018/1/24国内外研究进展,2018/1/24,23,1. R. PAILLOT, Immunology （2001）,Functional and phenotypic characterization ofdistinct porcine dendritic cells derivedfromperipheral blood monocytes,从1014周龄的商品长白猪采集血液，并分离,外周血单个核细胞（PBMC），一部分PBMC加入重组猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（1%rp GM-CSF）和重组猪白细胞介素一4（1%rp IL-4），一部分PBMC又多加了10ng/ml 肿瘤生长因子-1（TGF-1）。在39孵育16h后去除未贴壁细胞，贴壁细胞继续培养，每3天换一次液并补加细胞因子。7天后产生DC。加了 TGF-1的诱导产生的Mo LC（朗格汉斯细胞），比Mo DC更能对同种异体的T产生有效反应。,2018/1/24,24,2. I. E. Vincent，（2003）Dendritic Cells Harbor Infectious PorcineCircovirus Type 2 in the Absence of ApparentCell Modulation or Replication of the Virus实验动物是在SPF条件下饲养的PCV2血清反应阴性的瑞士长白猪，通过体外从骨髓和外周血提取DC前体细胞，诱导分化为骨髓来源的DC和单个核细胞来源DC，并与PCV2相互作用。研究发现8090%骨髓来源的DC和Mo DC参与到了PCV2病毒早期感染，并不能把抗原信息传递给T淋巴细胞，随着DC迁移，DC可作为在宿主体内运输病毒的媒介，病毒由此不需要复制就可以扩撒。外周血加入淋巴细胞分离液(比重1.077/L的Ficoll-Paque）进行密度梯度离心（1000g，25分钟）,得到的单核细胞用DMEM培养基培养，并同时加入 10%猪血清、 150ng/ml rp GM-CSF 、100U/mlrp IL-4,培养67天得到Mo DC。,2018/1/24,25,3.Randy E. (2006)Interaction of PRRSV and Porcine DendriticCells: Potential Role in Viral他们研究表明PDC（猪肺部DC）比Mo DC形态和功能更明显，而且Mo DC比PDC更易感PRRSV，并计划通过用CFSE（羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）染料体外标记的方法追踪PDC的移行，淋巴结或肺部的免疫组化染色则观察不到。外周血通过密度梯度离心法分离单个核细胞，贴壁细胞37摄氏度培养过夜之后，加入含有重组猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（rp GM-CSF）和重组猪白细胞介素一4（rp IL-4）培养基并37摄氏度培养两周，三天换一次培养基并补足细胞因子。两周后收获Mo DC，并稀释2 x 105DC中含有0.51摩尔的 PRRSV 的NADC-8。两小时后，洗Mo DC五次加入到组织培养板的空里培养， 40小时后由 PRRS V感染的细胞全部死亡。,2018/1/24,26,4.Dennis L. （2002）Differentiation of porcine dendritic cellsby granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expressed in Pichiapastoris因为GM-CSF和IL-4可以有效诱导出Mo DC，由P.Pastoris（毕赤酵母）分泌的重组GM-CSF可以作为猪疫苗的佐剂。,27,2018/1/24 5.CARLOS P.(2001 immune)Porcine dendritic cells generated in vitro:morphological,phenotypic and functionalproperties,猪的BM-DC 和 Mo-DC表达骨髓表面标志SWC3，CD1，CD80/86等，并且和人相比，猪的未成熟和成熟的DC表面都持久表达CD14 和CD16。外周血单个核细胞（PBMC）的分离是通过研究所的36周龄分离SPF猪外周血在淋巴细胞分离液作用下进行密度离心(1000 g, 25min) 得到的，单个核细胞是贴壁细胞经16h继续培养得到的。,2018/1/24,28,BMHC（骨髓造血细胞）和Mo用DMEM培养基培养，加入2Mm谷氨酰胺；100 U/ml 青霉素，100 mg/ml链霉素，50 M巯基乙醇。10%胎牛血清或10%猪血清（血清的替补品）。对于BMHC培养，25ng/ml (rp) GM-CSF，或单独，或与rp TNF-a(30 U/ml).联合作用。对Mo-DC的培养基又加入150 ng/ml rp GM-CSF, 100 U/ml rp IL-4and PS (Mo-DC medium)。BMHC用100-MM在39摄氏度孵育。培养的方法是借鉴人和鼠科动物BM-DC的培养。在BM-DC培养皿中加入10ml细胞密度为4105/ml的BMHC。第三天全换新培养液。在第六天和第八天各换一半培养液。培养六天时间里，BM-DC培养皿中由单核细胞（密度0.5106个/ml）产生了DC。为了让DC成熟，第二天和第四天在换一半新鲜培养液中，加入250 U/ml rpTNF-a 或 1 mg/ml脂多糖 (LPS) ，并继续培养24h（LPS）或48h(TNF-a)。TNF-a能提高BM-DC产量及刺激T细胞的能力， BM-DC 和Mo-DC能介导强烈的IFN-和IL-4反应。,2018/1/24,29,6.方慧云等。将外周血中的单个核细胞，经GMCSF和IL一4联合，并分三组。在三组收获前一天用加入分别TNF、INF一、Ag。结果表明添加TNF或INF一等促细胞成熟剂并没有达到进一步刺激细胞成熟的效果，但可以让细胞维持细胞生物活性的持续力。DC细胞与CIK细胞混合培养可以提高CD8+CD28+细胞群的比例，而且，CIK会因接受了抗原的刺激而增加细胞的扩增能力。,2018/1/24,30,7.马国强等。（2007）用rhGMCSF，rhIL-4和rhTNF联合培养从人外周血诱导培养出了大量的树突状细胞且高表达HLADR，CD80，CD83，CD86、HLADR+ CD83+及CD80+CD86+。8.黄家禹等。（2011）研究表明对 于 结核 病 患 者 外 周 血 树 突 状 细胞，LPS比 TNF-a有 着更强的刺激作用 ，能更好地刺激树 突状细胞成 熟。,2018/1/24,31,9. T.E. Cecerea，（2012 ，Veterinary Microbiology）Co-infection of porcine dendritic cells with porcine circovirus type 2a (PCV2a) andgenotype II porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) inducesCD4+CD25+FoxP3+T cells in vitro他们主要研究由PCV2 和PRRSV分别单独及共同感染的DC在体外诱导T Regs的能力大小。猪繁殖与呼吸综合征病毒可以在体外和体内诱导T Regs,PCV没有先关报道。由PRRCV诱导的TRegs的分化取决于病毒的基因型。PCV2 和PRRSV 共同感染在猪群中相当普遍，而且这两种病毒可以减少外周血单个核细胞(PBMC)对INF-的分泌和提高对IL-10分泌。体外PCV2感染的DC仅在胞质中发现PCV2抗原，而细胞核中没有发现，并且可以显著的增加CD4+CD25+FoxP3+Tregs(p 0.05) 。用这两病毒共同感染的这种能力比单独一种病毒感染的要强。,2018/1/24,32,用经肝素处理的注射器取五头健康猪的外周血，与无菌按:混合，用淋巴细胞分离液覆盖(比重1.077/L的Ficoll-Paque），并进行500 g 离心20 min。PBMCs 用DMEM洗三次之后，用完全DMEM培养基（10% 热灭火的胎牛血清, 50 2-巯基乙醇, 100IU /ml青霉素, 100 g /ml链霉素）悬浮，PBMC放在培养瓶在37C 、% CO2条件下过夜孵育，单核细胞会贴壁生长。非贴壁细胞用DMEM洗除，并用含有10% 二甲亚砜(DMSO)胎牛血清冰冻保存。贴壁细胞用含有20 ng/ml重组猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（rp GM-CSF）和20 ng/ml重组猪白细胞介素一4（rp IL-4）的DMEM培养基在 37C 、5%CO2培养五天。在第二天和第五天时换掉一半培养液， 第五天时加入LPS(2g/ml)，继续培养至少两天。第七天时用DMEM洗两次后，收集上清中的非贴壁细胞，即Mo DC。,2018/1/24,33,Mo DC用两种病毒的感染复数的0.1倍剂量感染，并在 37 C 用含有 50 mM 2-巯基乙醇DMEM培养基培养1小时。4 C 200 g洗三次，并用培养基重新悬浮。在96孔组织培养皿中加入5 104个/ml DC ，24小时候加入 5 105个/ml T淋巴细胞 （从PBMC中已经制备的），共同培养三天。在另外一些试验中，则换成热灭活的两种病毒或IFN-。每个实验组的DC和T淋巴细胞共培养一式三份。细胞因子分析表明，两种病毒共同感染对T Regs的作用依赖TF（生长转化因子）而不是。他们的研究支持猪圆环病毒相关疾病的发病机理，尤其是由T Regs介导的免疫抑制。,2018/1/24,34,10. Mwangi，（J.Immunol 2002）DNA-encoded fetal liver tyrosine kinass 3ligand and gramulocyte macrophage-colone-timulation factor increase DC recruitment tothe inoculation site and enheance Ag-specificCD4+ T cell reponses induecd by DNAvaccination of outbled animals他们通过构建抗DEC205单链Ab-Ag-CD40L嵌合体，通过DC和靶抗原集中在CD4+T细胞和CD8+ T细胞周围，直接刺激CD4+T细胞和CD8+ T细胞，提高DNA疫苗的效率，将这种载体与质粒FLT3L/GM-CSF混合免疫牛，可引起特异性CD4+T细胞反应。,2018/1/24,11.Kugler ， （Nat Med ，2002）Regression of metastatic renf cellcarcinoma after vaccination whit tumor cellDC hybeids.通过电穿法将自体肿瘤细胞与自体DC将融合，可将DC的免疫刺激功能与肿瘤A股信息有机的结合起来，从而更有效地诱导机体产生抗肿瘤免疫反应。由此可制成新型瘤苗。12.朱迅，2001将一些细胞因子的基因导入DC，使之有效表达，在用Ag触发致敏，可以用于治疗。将病原体Ag编码信息基因或m RNA导入DC后，能在DC内持续表达病原体抗原。,2018/1/24,脾脏DC,重组腺病毒载体进行GM-CSF基,因修饰,小鼠黑色素瘤细胞融合,贴壁细,胞培养，富集融合细胞。,2018/1/24,37,13.Dominguez，（Vet Res,2009）Targting to porcine sialoadhesin recrptorimproves antigen presention to T cells.这位西班牙学者提出了提高APC的Ag提呈能力的策略。他们利用猪唾液黏附素（sialoadhesin）的单克隆抗体增强Ag提呈给T细胞的能力。因为猪唾液黏附素可以针对特异性Ag的Ab生成。,2018/1/24,14.Exper Rev Vaccines，2009Mucasal vaccines: novel advances intechnolog and delivery(1)DNA疫苗通过将含Ag编码基因的质粒DNA直接导入DC，经体内转转录、翻译、加工，“天然地表达Ag蛋白”并通过内质网进入MHC类抗原提呈途径诱生CD8+T细胞应答。（2）由组织细胞摄取、表达、分泌，经由DC摄取而进入MHC 类抗原提呈途径诱生CD4+T细胞应答。由于可以模拟病毒的天然感染过程，因此可有效地诱生特异性抗体和细胞免疫应答，特别是CTL应答。,2018/1/24,39,15.曹雪涛，免疫学前沿进展，2009（1）只有PP结的DC能诱导T 细胞产生高水平的4 7，其它部位的DC无此作用。即PP结中的DC对效应T细胞归巢到肠道有选择性作用。（2）CCR9被证明是肠道归巢趋化因子受体，还是小肠中CD4+和CD8+记忆或效应T细胞的标志。CCR9与小肠上皮和血管上皮的CCL25结合，促进淋巴细胞进入小肠。并且CCR9和4 7具有协同作用。（3）小肠固有层的DC能够以一种TGF-和维生素A代谢产物维甲酸(RA)依赖的方式在体外诱导Treg，RA还可使活化的Th和B细胞上调表达肠道归巢受体4 7整合素和CCR9，从而是活化的免疫细胞趋引至远端的替他粘膜局部分泌S-lgA。,40,2018/1/24研究的目的与意义,目的：建立稳定、高效的猪树突状细胞体外培养的方法。意义：通过该方法获得足够数量的有功能的DC。为日后进一步研究提供材料。,41,DC培养：离心获取猪外周血白膜层细胞，裂解去除红细胞后获得全部白细胞，贴壁培养获得单核细胞，加入重组猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)+重组猪白细胞介素4(lL-4)，体外培养7、9、12 d获得DC，以流式细胞术分析表型，体外混合淋巴细胞反应检测细胞抗原提呈功能，电镜观察细胞形态。,2018/1/24技术路线,2018/1/24外周血,种板,PBMC的制备,5106/ml第7天,6106/mlMo DC的诱导第9天,7106/ml第12天,细胞表面标记物检测,细胞表面标记物检测、光镜与电镜观察、体外混合淋巴细胞反应42,细 胞 因 子,密度梯度离心,流式细胞仪,rp GM-CSF、rp IL-4,43,2018/1/241.PBMC的制备,裂解,从猪采集血液液去除红细胞,进行密度梯度离心获得全部PBMC。,2018/1/242.Mo DC的诱导,PBMC接板 加入重组猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和重组猪白细胞介素-4（IL-4） DMEM，16h后,贴壁细胞，每3天换一次液 培养第6天加TNFa 第7、9、12天收集DC,45,2018/1/243.观察DC形态,相差显微镜观察扫描电镜观察。,46,2018/1/244.体外混合淋巴细胞反应,同种异体淋巴细胞，作为应答细胞；培养的DC，作为刺激细胞；在96孔培养板中，按刺激细胞与应答细胞比为1：10、1：100、1：1 000接种，每个样品设3个重复孔，并设阴性对照孔(只加应答细胞)和对照孔(只加刺激细胞)，37下5CO2培养4 d后弃上清，每孔加MTT20ul/孔，孵育4h。吸去上清，加入DMSO100微升，室温微型振荡10min，测OD492值，结果以3孔均值表示，计算SI。实验数据经SPSS 110统计学处理，以xS表示，采用单元素方差分析法。SI=(试验孔OD-对照OD)阴性对照孔OD,47,2018/1/245.流式细胞术分析表型,CDla、CD14、CD16、CD80、CD83、CD86和HLA一DR取rGM一CSF、rIL一4和TNF一a刺激前的贴壁细胞，做为对照组。将GM一cSF、IL一4和TNF一a刺激后的悬浮细胞，作为实验组。二组标本一起上流式细胞仪，进行表型测定。,48,2018/1/24预期结果,成功建立成熟的 DC 体外培养技术,并通过有功能的 DC提高机体的免疫能力。,THANKS FOR YOU ATTENTION！,