牛支原体肺炎诊断技术规程DB42／T 1024-2014.pdf

IC S 11.2 20 B 41 备案号：DB42 湖北省地方标准 DB42/T 10242014 牛支原体肺炎诊断技术规程 Diagnostic procedures for Mycoplasma bovis pneumonia 2014 09 02 发布 2014 11 01 实施 湖北省质量技术监督局 发布 DB 42/T 1 02 4 20 14 I 目 录 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引 用文件.1 3 术语与定 义.1 4 牛支原体 肺炎诊断.1 4.1 流行病 学.2 4.2 临床症 状.2 4.3 病理变 化.2 4.4 分离培 养和鉴定.2 4.5 生化反 应鉴别检测.3 4.6 P CR 鉴 别检测.3 5 结果判断.5 附录 A（规范 性附录）试 剂的配制.6 附录 B（资料 性附录）牛 支原体肺 炎判 断流程图.8 附录 C（规范 性附录）生 化反应鉴别检测.9 DB 42/T 1 02 4 20 14 II 前 言 本标准按GB/T 1.12 00 9 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由华中农业大学提出。本标准由华中农业大学归口。本标准起草单位：华中农业大学、随州市弘大畜牧有限责任公司、松滋市春珍肉牛养殖场。本标准主要起草人：郭爱珍、白智迪、晁金、胡长敏、陈颖钰、陈焕春、彭清洁、曹永强、周春。DB 42/T 1 02 4 20 14 1 牛支原体肺炎诊断技术规程 1 范围 本规程规定了牛支原体肺炎诊断技术以及结果判定依据。本规程适用于牛支原体肺炎的诊断。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6 68 2 20 08 分析 实验室用水规格和试验方法 GB/T 1 86 49 20 02 牛 传染性胸膜肺炎（牛肺疫）诊断技术 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本规程。3.1 牛支原体 Mycopl asma bovis M.b oi vs 属于柔膜纲（Mo ll ic ut e s）支原体科（M yc op la sma ta ce ae）支 原体属（M yco pl as ma）成 员。与羊无 乳支原体（My co pl as ma a gal ac ti ae）关系密切，曾被命名为无乳支原体牛亚种（Myc op la s ma ag al ac ti a e su bs p.Bo vi s）。主要导致化脓性或凝固性坏死性肺炎，还可发见关节炎、腱鞘炎、角膜结膜炎、中耳 炎、乳腺炎等。3.2 聚合酶链式反应 po lym erase cha in r eacti on PC R 是一种级联 反复循环的DNA合成反应过程。一般 由三个步骤 组 成：模板 的 热 变性，寡核苷酸 引 物 复 性 到 单 链靶序 列 上 以及由 热稳 定DN A 聚 合 酶催 化的复性引 物 引导的新生D NA 链延伸聚 合反应。3.3 胸膜肺炎样微生物 pleu ropnenmonia-like o rg anis m PPLO 即 支原体（My co pl as ma），因 为最 初认识 的支原体病为牛传染性胸膜肺炎（cont ag io us pl eu ro pn eu m on ia），所以 将该 病的 病原命名为 胸膜肺炎 微 生 物（p l e uro pn eu mo nia or ga nism，P P O)。之后，在 人和 动物 的 呼吸道、消 化 道 和 泌尿 生殖 道 分离出 多 种 特征相同 的 微 生 物，统称 为胸膜肺炎 样微 生 物(P le uro pn eu mo nia like or ga nis m)，简称 PP LO。4 牛支原体肺炎诊断 DB 42/T 1 02 4 20 14 2 牛支原体肺炎诊断技术分为流行病学分析，临床症状 观察，病理变化检 查，支原体 纯 化和反应鉴别 检测，PC R鉴 别检测等，确 诊有 赖 于2 种或2种以 上 方法的联用与 综 合判断。4.1 流行病学 育肥 牛 多 发，与应 激（长 途运输、热 或 冷 应 激、抵抗力 下 降 等）相 关。牛 运达后 1周 2周发病，运 输途 中 经历恶劣气侯 可 加快 发病。病程1个 月 以 上。年龄越小 病 情越严重。初 生 犊 牛 也 可发病，1周 2周 龄左右 出 现明显 的 呼吸道 症状和关节炎症状，与 吸吮含 牛支原体的 母 乳有关。4.2 临床症状 发病 率 60%以 上，死 亡率 可 高达 10%50%。初 期发 热，体 温升 至 42 左右；有清 亮 或脓 性 鼻汁，咳 嗽，气喘，半夜 及清 晨咳嗽加剧；精神沉郁，食欲减退；眼 结膜 潮红，流 浆液 性或脓性分 泌物。病程 较 长 时，患 牛 明显消瘦，可见关节炎，表现 为关节脓 肿，跛 行 甚至卧地 不起；也 可见 腹泻，粪 便呈 水 样，可 能带 有 血液 和 黏 膜；可见中耳炎。严重者 可发生死 亡。常 规 抗 生 素治疗效 果 差，病 情 反复发作。4.3 病理变化 主要 集 中 在 肺部与胸 腔。肺和胸膜可 能粘连，胸 腔积液；心 包 积液；肺部病变 轻者 可见肺 尖叶、心 叶 及部分 膈叶边缘局 部可见 红色 肉变，重者 可见大 面积 肉变 区内广泛 分 布 有 黄 白 色干酪样 坏死 灶 或化脓 灶。其 它 病变与 继 发症或 并 发症有关。发生关节炎 时，可见关节 腔积液，有大 量干酪样 坏死 物。4.4 分离培养和鉴定 4.4.1 病料采集 无 菌条 件下 取样，首选 肺 组织，其 次 为 鼻腔深 部分 泌物 和 气管 分 泌物。在 肺 组织 病变与 正常组织交界处，取 3 cm3 5 cm 3 大 小 的 组织样 本，冷藏条 件下 快速送 检或 置 无 菌 40%50%甘 油 生理 盐 水中，冷藏条 件下 快速送 检 按 照 GB/T 18 64 92 00 2 进 行。气管 分 泌物 可 直接收集，冷藏条 件下 快速送 检。鼻拭子采集后置装 有0.5 mL 1.0 mL 灭菌 生理 盐 水的无 菌Ep pe n do rf管 中，盖严，冷藏条 件下 快速送 检。所有 样 本 均须妥善 包 装，防渗漏，防破 碎。标 签 用 记号笔填 写，应 信息完整，字迹 清 晰，并 附 采样 单。4.4.2 分离培养 4.4.2.1 材料准备 本方法的试验用水应 符 合GB/T 6 68 2 20 08规定 的 二 级水，所用化学试剂 均 为分析 纯。培养 基：支原体 液 体培养 基 见附录A 中A.1,固体 培养 基 配制见附录A中A.2。4.4.2.2 操作方法 肺 组织 的 初 代 接 种培养方法按 照 G B/T 18 64 9 2 002 进 行，在表 层 消 毒 后，在 病变和 正常组织交界处 取 米粒 至 绿豆 大 小深 层 肺 组织，先 在 支原体固体培养 基 表面进 行 样 本切 面 涂抹，再 在 涂抹 处 划线，将 病 料 接 种于培养 基 表面，置 于3 7、5%C O 2 恒 温 培养 箱 中培养，2 d 3 d后，在 光 学 显微 镜 下4 10 倍放 大，可 观察 支原体 典型 的“煎蛋 样”菌 落形态。DB 42/T 1 02 4 20 14 3 鼻拭子样 本于 采集管 中 涡旋 5 mi n，取 40 0 L 悬 液经 45 0 nm 孔径 滤 膜过 滤，取 10 0 L 滤 液均 匀涂 布 于 支原体固体培养 基 表面，置 于3 7、5%C O 2 培养 箱 培养,2 d 3 d后,用 光 学 显微 镜 4 10 倍 观察菌 落形态。纯 化或 转 接时，从 支原体固体培养 基挖 取带 支原体 菌 落 的 小 块琼脂，涂抹、再划线 接 种于固体培养 基 表面，或 接 种于支原 体 液 体培养 基 中，置 于3 7 恒 温 培养 箱 中，2 d 3 d后,观察 培养 基 上 生长 的 典型 菌 落 或 观察到液 体培养 基 由 红色 透 明 变为 橙 黄色 透 明时，表明 有支原体生长。4.5 生化反应鉴别检测 4.5.1 材料准备 生化 管：葡萄糖、甘 露醇、精 氨 酸、尿素、磷 酸酶 等生化 管 为 商品 化试剂。牛支原体 H B0 801 株 作为牛 支原体 阳 性对 照，保存 于中 国典型 培养 物 保 藏 中 心，保 藏号 为CCT CC N o:M 20 10 04 0。4.5.2 操作方法 吸取 10 L（约 10 7 C FU）的 牛支原体 液 体 纯 培养 物，分别 深 部 接 种于 各 种生化 管 中，置 于3 7 恒 温 培养 箱 中，1 2 h 24 h 后观 察 结果。牛支 原体不分 解葡萄糖、甘 露醇、精 氨 酸 和 尿素，但具 有 磷 酸酶 活 性，其牛支原体生化反应鉴别见附录C。4.6 PC R鉴别检测 4.6.1 16 S rRNA P C R 检测 利 用16 S r RN A 通 用引 物，进 行PC R 扩增，将 PC R 产 物 测 序，获得 序 列与G en B an k 中的 序 列 进 行 同 源 性 比 对，鉴定牛支原体。但 该 方法不 能区 分牛支原体与无乳支原体。4.6.1.1 仪器和耗材 PC R 仪，电炉，离 心 机，混匀器，微量 可 调移 液 器，1.5 mL Ep pe nd or f 管，PC R反应 管，核酸 电泳仪，凝 胶 成 像 系 统。4.6.1.2 试剂 灭菌 双蒸 水，T a q M i x，琼脂糖。4.6.1.3 样本处理 在 肺 组织 病 健 交界处取 一 小 块 深 层 组织置 于 玻璃 匀 浆 器 中，加 入 3 mL 4 mL灭菌 PB S，反复 挤压 组织 块，制 成 组织 悬 液。将组织 悬 液 自然 沉 淀 10 mi n，取上 部 液 体 通 过0.45 m 孔径 的 滤 膜过 滤 后，将 滤 液 作 为 待 检 样 本。鼻拭子样 本按4.4.2.2方 法 处 理，将 滤 液 作为 待 检 样 本。牛支原体 液 体培养 物 无 需 处 理，作为 待 检 样 本 直接进 行 模板 提 取。4.6.1.4 模板提取 吸取 4.6.1.3 中1 mL 待 检 样 本于1.5 mL 离 心管 中，13 000 g 离 心 15 mi n,沉 淀溶 于500 L纯 水中，煮 沸 10 mi n，冰浴 1 mi n，1 300 0 g 离 心 30 s，取上 清作 为DN A 模板。牛支原体 阳 性对 照模板 为牛支原体 H B0 80 1 株 的D N A。4.6.1.5 引物序列 DB 42/T 1 02 4 20 14 4 利 用16 S r RNA 通 用引 物进 行PC R 扩增，引 物序 列 如 下：16 S r RN A 上 游 引 物:5-A CG CG TC GA CAG AG TT TG AT CCT GG CT-3 16 S r RN A 下 游 引 物:5-C GC GG AT CC GCT AC CT TG TT ACG AC TT-3 4.6.1.6 PC R 反应体系 总 体 积 20 L，其中2 T a q M i x 10 L，上 下 游 引 物(10 mo l/L)各 0.8 L，牛支原体 DNA 模板 3.0 L（30 ng/L），去 离 子 水5.4 L。4.6.1.7 PC R 反应产物 检测 94 预 变 性10 m in后，9 4 变性1 mi n，6 0 退 火 1 mi n，7 2 延伸 1 mi n，3 0个循 环 后，7 2 延 伸 7 mi n。PC R 产 物 预 期大 小 为 1 600 b p。将 PC R 产 物进 行0.8%琼脂 糖 凝 胶电泳（5 V/cm 下，电泳 30 mi n），浸泡 在 溴 化 乙锭（E B）（0.5 g/mL）缓冲溶 液 中或 1:1 000 染 料 G el R ed(B io ti um)（1.3 g/mL）中染 色 15 mi n，紫外灯 下 观察，P C R 产 物 大 小 应为16 00 b p。将 PC R 产 物送 商 业公司 进 行 序 列测定。利 用B L A S T 软 件 将 16 S r RN A 扩增产 物序 列与G en B an k 中牛支原体1 6 S r RN A 序 列（G en B an k 登 录 号:U 02 96 8）进 行 同 源 性 比 较，同 源 性应 在 99%以 上；与无乳支原体（My co pl as ma ag ala ct ia e）1 6 S r RN A(G en B an k 登 录 号:C U 1 7 96 80)同 源 性 也在 99%以 上。4.6.2 Uv rC P CR 检 测 4.6.2.1 仪器和耗材 见4.6.1.1 条 款。4.6.2.2 试剂 见4.6.1.2 条 款。4.6.2.3 样本处理 见4.6.1.3 条 款 4.6.2.4 模板提取 见4.6.1.4 条 款。4.6.2.5 引物序列 利 用牛支原体 特 异 性 基 因 Uv r C的 特 异 性 片段设计 引 物，该 引 物序 列对牛支原体 保守，但 可 区 分无乳 支原体和其 他 支原体，目 的 片段 位于 Uv r C 基 因 14 50 nt 至 16 8 7 nt之 间，大 小 为23 8 b p。引 物序 列 如 下：Uv r C1 上 游 引 物：5-TAA TT TA GA AG CTT TA AA TG AG CGC-3 Uv r C2 下 游 引 物：5-CAT AT CT AG GT CAA TT AA GG CT TTG-3 4.6.2.6 PC R 反应体系 见4.6.1.6 条 款。4.6.2.7 PC R 反应和产 物检测 DB 42/T 1 02 4 20 14 5 94 预 变性 5 m in后，9 4 变性1 mi n，5 3 退 火 30 s，7 2 延 伸 30 s，3 0 个循环 后，7 2 延伸 10 mi n。反应结 束 后，将 PC R 产 物进 行2%琼脂 糖 凝 胶电泳（5 V/cm 下，电泳 30 mi n），溴 化 乙锭（E B）染 色 5 mi n，阳 性 样 本有一 条 23 8 b p 的 目 的 条带。5 结果判断 以 上 检测方法 需 联合 运 用，应 能 得 出 确 诊结果，见 附录B。结果判断 按 如 下标准 之 一 确 诊为牛支原体肺炎。5.1 临床 初 步诊断为牛支原体肺炎：病料支原体分离培养 获得典型 菌 落；纯 培养 物 生化鉴定 符 合牛支 原体生化 特征；5.2 临床 初 步诊断为牛支原体肺炎；病料支原体分离培养 获得典型 菌 落；纯 培养 物 用 通 用1 6 S r RN A PC R扩增 和测 序 分析，与 G en B an k 数 据 库 中牛支原体 1 6 S r RN A 为 99%；5.3 临床 初 步诊断为牛支原体肺炎；病料 直接进 行1 6 S r RN A PC R 扩增 和测 序 分析，与 G en B an k 数 据 库 中牛支原体 1 6 S r RN A 为 99%；和/或用 特 异 性 u v r C P CR 扩增 出一 条 23 8 b p 的 目 的 条带；5.4 临床 初 步诊断为牛支原体肺炎；病料 直接进 行P C R 扩增阴 性 时，应 将 病料 进 行支原体分离，再 用 纯 培养 物进 行P C R 扩增 和 产 物 分析 后，按 5.2 进 行判断。DB 42/T 1 02 4 20 14 6 附 录 A（规范性附录）试 剂 的 配 制 本附录规定 了牛支原体 培养 基、TA E 电泳缓冲 液、8 万国际 单位/mL 青霉 素 溶 液、1%酚 红 溶 液、琼脂糖 和 7.0 mo l/L 甜菜碱（三 甲基 甘 氨 酸）（PC R级）的配制。A.1 牛支原体液体培养基 将 PP LO 肉 汤粉 10.5 g，酵 母 粉 2.5 g，丙酮 酸 钠 0.5 g，溶 于4 4 0 mL 超 纯 水中，11 6 灭菌 20 mi n 后，添 加 马 血 清5 0 mL，1 0 M E M 5 mL,8 万 单位/mL 青霉 素 溶 液 5 mL,1%酚 红 溶 液 500 L，定 容 至 50 0 mL，置 4 保存备 用。A.2 牛支原体固体培养基 将 PP LO 肉 汤粉 10.5 g，酵 母 粉 2.5 g，丙酮 酸 钠 0.5 g，琼脂粉7.5 g,溶 于44 0 mL 超 纯 水中11 6 2 0 m in 25 mi n后，添 加 马 血 清50 mL，1 0 M E M 5 mL,8 万 单位/mL 青霉 素 溶 液 5 mL,定 容 至 50 0 mL，倾平 板，待 培养基 凝固 后，置 4 保存备 用。A.3 TA E电泳缓冲 液 T ri s 4.8 4 g/L,冰乙 酸 1.14 2 mL/L，E DT A(p H 8.0)，0.0 01 m mol/L,定 容 至 10 00 mL。A.4 PB S缓冲液（pH 7.27.4）N a C l 1 3 7 m mol/L，K C l 2.7 mm ol/L，N a 2 H P O 4 4.3 mm ol/L，KH 2 P O 4 1.4 mm ol/L。用 H C l 调 p H值 至 7.4，定 容 至 10 00 mL，1 21，3 0 mi n高 压 灭菌。A.5 8 万国际单位/m L青霉素溶 液 取 400 万国际 单位的 青霉 素 粉 剂，溶 于50 mL 双蒸 水中,至完 全溶 解 后，0.2 2 m 细 菌 滤器 过 滤除 菌，滤 液置 4 保存 备 用。A.6 1%酚红溶液 称取 1 g 酚 红加 入 1 mo l/L N aO H溶 液 2 mL，不断 搅拌，将 已 经 溶解 的 酚 红 溶 液 倒入容器 中；未溶解 的 酚 红继 续 加 1 mo l/L N aO H溶 液 2 mL，重 复 上 述 步骤（N aO H溶 液 总 量 不可 超 过6 mL）；加 双蒸 水 至 100 mL，11 6 灭菌 15 mi n后，至 4 保存。A.7 琼脂糖 2%琼脂糖 凝 胶：琼脂糖粉 2 g，去 离 子 水10 0 mL,加热 充 分 溶解，趁 热 倒入 核酸 电泳槽胶槽 中。0.8%琼脂糖 凝 胶：琼脂糖粉 0.8 g，去 离 子 水10 0 mL,加热 充 分 溶解，趁 热 倒入 核酸 电泳槽胶槽 中。DB 42/T 1 02 4 20 14 7 A.8 7.0 mo l/L甜 菜碱（三甲基甘氨酸）（P CR级）甜菜碱 0.82 g，加灭菌 超 纯 水 溶解，终 体 积 定 容 至 1 mL，0.2 2 m 细 菌 滤器 过 滤除 菌，-20 保存。DB 42/T 1 02 4 20 14 8 附 录 B（资料性附录）牛支原体肺炎判断流程图 图 B.1给出了 联合 运 用判断牛支原体肺炎的 基 本流程。图B.1 牛支 原体肺炎判断流程 16s rRNA PCR产 物序 列测定 流行病学和临床 初 步诊断 病料 采集 病料 处 理 牛支原体培养分离 低倍 显微 镜 观察 支原体 典型 菌 落 生化反应鉴别检测 PCR 鉴别检 测 uvr C 特 异 性 PCR 牛支原体肺炎的 确 诊-+-+DB 42/T 1 02 4 20 14 9 附 录 C（规范性附录）生化反应鉴别检测 表 C.1 给出 了牛支原体生化反应鉴别检测的判断依据。C.1 牛支原 体生化反应鉴别检测表 表 1 生化反 应结果判定 种名 分解葡萄糖 分解甘露醇 水解精氨酸 分解尿素 磷酸酶活性 牛支原体-+精氨酸支原体-+-无乳支原体-+丝状支原体丝状亚种+-绵羊肺炎支原体+-注：+反应阳性，-反应阴性。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _