2019医疗行业基因诊断发展分析报告.pptx

,2019医疗行业基因诊断发展分析报告,目录,1.1基因诊断：针对性强、特异性好、灵敏度高、应用广泛,基因 诊断,基因诊断（gene diagnosis）是利用现代分子生物学技术，从DNA/RNA 水平进行检测，分析体内致病基因的存在、变异和表达等状态，从而对疾 病作出诊断的过程。针对 性强,灵敏 度高,应用 广泛,特异 性好,1.2基因诊断的基本策略,（1）对基因突变的检测点突变的检测：如对已知突变位点进行的产前诊断大片段核苷酸丢失或插入的检测：如Duchenne肌营养不良的诊断基因重排的检测：如Burkitt淋巴瘤是8#染色体的c-Myc基因转移至 14#染色体的免疫球蛋白重链基因调控区基因扩增的检测：如乳腺癌中成纤维细胞生长因子基因家族的扩增可达100+拷贝（2）对基因表达异常的检测：主要检测mRNA水平的表达（3）对病原体基因的检测：如HIV、HPV、乙肝病毒等的基因诊断随着技术的革新和方法的普及，现实中通常采用多种方法联合的检测手段。,1.3.1,基因诊断的临床应用：遗传病的基因诊断,镰状红细胞贫血（Sickle-cell anaemia, SCA）： 常见的遗传病之一，-肽链6#谷氨酸被缬氨酸所代 替，构成镰状血红蛋白（Hb-S），替代正常Hb-A。,正常,携带者,患者,1.3.2基因诊断的临床应用：遗传病的基因诊断,囊性纤维化：囊性纤维化穿膜传导调节器（CFTR）是一个含有1480个氨基酸残 基的蛋白质，对跨膜转运调节起重要作用。CFTR基因突变，可引起呼吸系统、胃 肠道、肝胆系统及生殖道等上皮细胞的离子转运异常，最终可致囊性纤维化。 CFTR基因存在1000多种突变形式，不同突变形式的诊断对治疗起到重要作用。,1.4.1基因诊断的临床应用：肿瘤的基因诊断,检测原癌基因：Ras蛋白是 原癌基因Ras的表达产物， 是Ras-Raf信号通路的重 要成员，该通路被激活可 导致细胞增殖。如Ras基因 发生突变，使Ras蛋白失去GTP水解酶活性，GTP不 能及时水解，该信号通路 会持续激活，导致细胞增 殖。该突变可引起泌尿系 统肿瘤和淋巴细胞白血病。,细胞的增殖，存活，区别,GTP酶活化蛋白（GAP）,Ras-Raf信号通路：配体RPTKadaptorGEFRasRafMAPKKMAPK进入细胞核转录因子,1.4.2基因诊断的临床应用：肿瘤的基因诊断,检测抑癌基因：p53基因位于17#染色体，p53蛋白是DNA结合蛋白，也是转录活 化因子，在应答DNA损伤时常引起细胞周期紊乱。50%-60%的恶性肿瘤均与该基 因有关，检测p53编码区的错义突变、单碱基插入和缺失等变异，可实现癌症早筛。,目录,2.1核酸分子杂交技术,核酸分子杂交（molecular hybridization of nucleic acid）是指不同来源的 核酸单链在退火（复性）时能以碱基配对的方式重新形成双链。该杂交反应既可以在两条DNA单链间形成，也可以在RNA与DNA单链间形成， 其实质是核酸的变性与复性。不完全互补的两条核酸单链也能杂交结合，但碱基互补程度越高或互补区段越 长，双链之间的结合也就越牢固。,（或DNA-RNA杂交双链分子）,2.2Southern blot,限制性酶切 基因组DNA,电泳,转印,硝酸纤维素膜,放射性探针,检测杂交结果,利用标记的探针（probe）与转印膜上 靶DNA片段进行杂交的 技术，检测DNA片段中 是否存在与探针同源的 序列；杂交过程具备高度特异 性，可根据所使用的探 针（序列已知）进行特 异性序列检测。,2.3,Northern blot,通过探测样品中的RNA（或隔离的mRNA）来 研究基因表达；主要用于检测基因结构改 变以及在RNA水平的基 因表达异常，进而推测基 因启动区碱基序列是否改 变或是否转录异常；操作原理和过程与 Southern blot类似。,RNA提取,电泳,转印,标记探针,检测杂交结果,2.4Southern/DNA, Northern/RNA, Western/Protein,2.5Dot blot,无需电泳，将RNA/DNA 样本变性后直接点样于固 相支持物上，然后与标记 的探针进行杂交，常用于 特定基因及其表达产物的 定性与定量研究；反向斑点印迹（reverse dot blotting，EDB）： 现将探针点样于固相支持 物上，再用标记的样本进 行杂交。,准备稀释液,点样与杂交,2.6荧光原位杂交（FISH）,变性,变性,嵌入标记地高辛（或 生物素）的核苷酸,荧光素标记的 特异性抗体,荧光显微镜检测,荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH） 将荧光素标记的DNA片 段与染色体或染色质杂 交，用于基因定位研究。FISH技术可检测特定基 因片段的缺失、扩增与 重排，也可用于对遗传 病及肿瘤的诊断和分型。,目录,3.1PCR技术的基本原理,以DNA分子为模板，加入与待扩增片段两侧序列互补的一对特异寡核苷酸链作引物（primer），在耐热DNA聚合酶的催化下，分别合成两条新的DNA互补链；每一个反应周期包括变性、退火、延伸，多次重复这一周期性反应过程，结果使两 个引物之间的DNA片段拷贝数以几何级数增加。,变性,退火,延伸,引物,寡核苷酸,DNA模板,3.2反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）,反转录PCR以RNA为模板， 先反转录生成cDNA，再对 cDNA进行PCR扩增；作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物，关键是确保RNA 中无RNA酶和gDNA的污染；可分为一步法（病毒检测） 和两步法（mRNA解析）；常用于从组织或细胞中获取 目的基因、检测基因结构以 及研究mRNA表达水平。,逆转录酶,脱氧核苷三磷酸,3.3实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）,与常规PCR相比，无需电泳，通过荧光信号积累实时直观地监测整个PCR反应进程。,荧光基团,淬灭基团,由于这两个基团 靠得很近，没有 荧光信号产生,荧光基团远离淬灭基团并释放荧光信号,Molecular Beacon/分子信标模式,3.3,实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）,TaqMan Probe模式,Taq酶将探针水解成单个碱 基，荧光基团的能量无法传 给淬灭基团，只能通过发射 特征光子回到稳定态。,Hybridization Probe/杂交探针模式,两个探针，一个探针3碱基上结合感光基团（Donor），另一个探针5碱基上结合荧光基团（Acceptor）。当两个探针特异性结合到模板上时， Donor接受激发光得到能量，并将能量传递给Acceptor，Acceptor通过发射特征光子回到稳定态。,3.4多重PCR（multiplex PCR）,在同一反应体系中加入二对以上引物，同时扩增出多种核酸片段的PCR反应，其 反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR类似；多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传 病及癌基因的分型鉴定。,3.5PCR等位基因特异寡核苷酸探针杂交（PCR-ASO）,正常球蛋白基因,突变球蛋白基因,突变 纯合 子,野生 纯合 子,杂合子,根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备野生型或突变型基因序列互补的 两种探针，与被检测者样品中的DNA分子进行杂交；根据样品与这两种探针杂交 信号的强弱，确定判断样品是野生纯合子、突变纯合子或杂合子。,3.6PCR扩增抗拒突变系统（ARMS-PCR）,当引物3末端与 模板5末端存在 错配时，可引起扩增产物的急剧减少；通过设计适当的引 物，使正常模板引 物扩增正常等位基 因，突变模板引物 扩增突变基因；进 而通过PCR扩增直 接达到区别野生型 和突变型的目的。,野生纯合子,杂合子,突变纯合子,对照引物,突变型引物,野生型引物,目录,4.1DNA序列测定（DNA sequencing）,DNA序列测定（DNA sequencing）是确定DNA片段的全序列，是目前确定基因突变和 检测基因变异最准确可靠的方法。利用测序信息，能够识别基因的变化，基因与 疾病和表型的关联，并确定潜在的药物靶点。人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）于1990年正式启动，2006年完成；其 宗旨在于测定组成人类染色体（22+X+Y）中 所包含的六十亿对组成的核苷酸序列，从而绘 制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及 其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。,4.2Sanger测序法（Sanger sequencing）,Sanger测序法，又称双脱氧 链终止法（dideoxy chain- termination method）， 反应核心在于使用的ddNTP： 由于缺少3-OH基团，不能与 另一个dNTP连接形成磷酸二 酯键，可中止DNA链的延伸。 此外，ddNTP上连接有放射 性同位素或荧光标记基团，因 此可被自动化仪器或凝胶成像 系统所检测到。,ddNTP,毛细电泳,4.3焦磷酸测序法（Pyrosequencing）,焦磷酸测序法适于已知的短序列，其可重复性和精确性能与Sanger测序法相媲美， 但速度却大幅提高。其原理为酶级联化学发光反应，具体而言，每一个dNTP的聚 合均会释放一次荧光信号，通过检测荧光的信号强度，达到实时测序的目的。,DNA聚合酶,三磷酸腺苷双磷酸酶,荧光素酶,ATP硫酸化酶,每轮反应加入 一种dNTP,通过微弱光检测装置及处理软件 可获得一个特异的检测峰，峰值 的高低和相匹配的碱基数成正比,4.4边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）,Illumina的边合成边 测序（SBS）是目前 世界上最成功且最广 泛使用的NGS技术。当每个dNTP加入时， 对荧光标记的可逆终 止子进行成像，随后 切割以利于后续加入； 在每个测序循环中， 所有四种可逆终止子 结合的dNTP都存在。,文库制备,边合成边测序,桥式PCR,切割,荧光基团,终止端帽,荧光释放,4.5边连接边测序（Sequencing by Ligation，SBL）,SBL中，带有荧光基团 的探针与DNA片段杂交 并且与临近的寡核糖核 酸连接，通过荧光基团 的波长来判断碱基序列。SOLiD平台使用双碱基 编码的探针，每四种组 合使用一种荧光信号（共四种）；其测序过 程由一系列的结合，连 接，图像获取以及切割 的循环组成。,双碱基编码探针,4.6,NGS Workflow,样本提取，DNA片段化，体外接头衔接,基于乳化PCR的克隆扩增,基于桥式PCR的克隆扩增,焦磷酸法,边连接边复制,边合成边复制,4.7,常见测序方法对比,Thank You,