猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的制备和鉴定DB22／T 2394-2015.pdf

ICS 65.020.30 B 43 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 23942015 猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的 制备和鉴定 Regulation of preparation and identification of induced pluripotent stem cells from pigs 2015-12-15发布 2016-01-25实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 23942015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由吉林省标准研究院提出。本标准由吉林省畜牧业管理局归口。本标准起草单位：吉林省标准研究院。本标准主要起草人：赵慧明、张学明、李子义、唐博、崔娜娜、王琪、杨磊。DB22/T 23942015 1 猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的制备和鉴定 1 范围 本标准规定了源于猪胎儿成纤维细胞的猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的工作区条件、主要仪器设备、清洗与消毒、试剂及液体配制、猪iPSCs的制备、警示、标签及其他要求。本标准适用于猪iPSCs在畜牧业生产实践、基础医学研究和临床医疗等方面的应用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 15562.2 环境保护图形标志 固体废物贮存（处置）场 GB/T 24863 畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程 HG/T 3935 哺乳类动物细胞培养基 NY/T 1900 畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 SN/T 2330 化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 诱导多潜能干细胞 induced pluripotent stem cells(iPSCs)通过转染特定的转录因子（如经典的胚胎特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4组合），从已分化体细胞（如成纤维细胞）重编程而获得的多潜能干细胞。3.2 猪胎儿成纤维细胞 porcine fetal fibroblast(PFF)从妊娠25-30天猪胎儿中，去头、尾、四肢、骨骼、内脏后，消化分离获得的有良好增殖能力的细胞。3.3 饲养层细胞 feeder layer cell 将动物胎儿成纤维细胞经丝裂霉素C处理后，失去分裂增殖能力的活细胞。3.4 拟胚体 embryoid body 釆用悬滴法培养，将干细胞或iPSCs克隆消化成单细胞，检测其体外发育分化能力的方法。3.5 畸胎瘤 teratoma DB22/T 23942015 2 采用皮下注射法，将干细胞或iPSCs注射到免疫缺陷鼠皮下组织中，在SPF级条件下饲养，被注射细胞在体内形成的含三胚层组织结构的瘤体组织。4 工作区条件 4.1 工作区域一般由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室、SPF 实验动物饲养设施等组成，内部设备条件按照 GB/T 24863 和 SN/T 2330 执行。4.2 缓冲间应不小于 3 m2，并设有更衣柜和紫外灯；紫外灯的强度1.5 W/m3，紫外灯管距地面不应超过 2.5 m，每次照射时间 30 min 以上。4.3 无菌室的最低标准应达到万级，并配备通风设备。5 主要仪器、设备 超净工作台、生物安全柜、冰箱、液氮生物容器、离心机、CO2培养箱、纯水装置、高压蒸汽灭菌器、电子天平、倒置显微镜、荧光显微镜、PCR仪、荧光定量PCR仪、-80超低温冰箱。6 清洗与消毒 所用玻璃器皿和金属器材的清洗与消毒按照GB/T 24863执行。7 试剂及液体配制 各种使用液均用去离子水配制，充分溶解，立即用0.22 m滤膜滤过除菌，除特殊说明，均分装贮存于-20下备用，并执行GB/T 24863和NY/T 1900。包括：水、DMEM(dulbeccos modified eagle medium)培养基、青-链霉素、无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA、冻存液、丝裂霉素C、LB培养基、293细胞培养基、转染培养基、Opti-MEM、ES培养基、条件性培养液、IV型胶原酶（见附录A.1A.14）。8 猪 iPSCs 的制备 8.1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备 将见栓12.5 d的SPF级（无特定病原体）ICR品系孕鼠用脱颈法处死，分离、培养胎儿成纤维细胞，原代细胞生长至约90%密度时进行传代、丝裂霉素C处理、清洗、消化、计数、冻存。（具体步骤见附录A.15）。8.2 猪胎儿成纤维细胞制备 8.2.1 取材 无菌手术取出妊娠25 d30 d的猪子宫，两端扎紧后运回实验室，将子宫整个浸泡于75%的酒精中消毒30 s，将消毒后的子宫送入细胞培养室中，剪开子宫，取出羊膜完整的胎儿置于75%的酒精中浸泡30 s，取出用PBS洗3次后移入生物安全柜中。用剪刀将胎儿去除头、尾、四肢、内脏、脊椎骨及肋骨，用PBS冲洗剩余组织，将组织剪碎至组织块直径均小于1 mm。8.2.2 消化 DB22/T 23942015 3 加入少量PBS，将组织块吸出置于50 ml离心管中，加入10 ml 0.25%胰酶-EDTA溶液，置于37培养箱中消化15 min，间隔2 min3 min吹打一次。消化结束后加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM终止消化，轻轻吹打将细胞重悬，使用200目筛网过滤，收集滤液，300 g离心8 min，弃净上清液。8.2.3 培养 加入10 ml 含10%FBS的DMEM将细胞重悬，移入2个T-75培养瓶中，每瓶再加入10 ml培养液，置于培养箱中，37.5、5%CO2条件培养培养，24 h后换液，去除悬浮的细胞。待细胞铺满培养瓶面积的80%90%（2 d3 d），可将细胞进行冻存或传代。8.3 诱导 iPSCs质粒制备 8.3.1 转化 将包含4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4，参见附录）和绿色荧光蛋白（GFP)的逆转录病毒质粒（pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc和pMX-GFP)及辅助质粒Vsvg分别转入DH5感受态细菌（见附录A.16）。8.3.2 筛选 向每管细菌中加入液体LB培养基900 l，置于恒温摇床中37下120 rpm震荡45 min；从每管中吸取100 l液体，均匀滴于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，使用涂菌棒涂匀后，置于37生化培养箱中培养12 h。出现明显菌落后，使用小枪头挑取菌落置于5 ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37、200 rpm震荡12 h。8.3.3 质粒提取和浓缩 将上述菌液加入到200 ml新鲜含氨苄青霉素液体LB培养基中，37下200 rpm震荡12 h，用OMEGA无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒；测提取质粒的浓度，用冰乙醇沉淀法（见附录A.17）浓缩质粒，使质粒浓缩达到1 g/l以上，标记后置于-20冰箱保存备用。8.4 逆转录病毒制备 8.4.1 293 细胞培养 用T-75培养瓶和293细胞培养基，在37.5、5%CO2条件下培养293GT细胞，培养第2 d，待细胞生长至60%70%密度时吸出旧培养液，加入10 ml转染培养基置于培养箱中备用。8.4.2 转染 将pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc、pMX-GFP和Vsvg质粒各10 g加入1 ml Opti-MEM中混匀；将50 l Lipofectamine 2000转染试剂加入1 ml Opti-MEM中混匀，室温孵育5min；将上述两种溶液混匀并室温孵育20 min。将上述溶液加入293GP细胞中晃匀后，置于培养箱中，37.5、5%CO2条件培养，每2 h晃动一次培养瓶，培养6 h后吸去培养液，换为12 ml新鲜293细胞培养液培养。8.4.3 逆转录病毒液收集 培养第4天，收集293GT细胞培养液，使用0.45 m滤器过滤，标记好后置于4冰箱保存；再向293GT细胞中加入12 ml 293细胞培养基继续培养，第5天再次收集细胞培养液，使用0.45 m滤器过滤后与第4天收集的上清混匀后置于4冰箱保存备用。DB22/T 23942015 4 8.5 猪iPSCs 的诱导 猪 iPSCs 的诱导过程如下：a)D0 将3 代以内猪胎儿成纤维细胞培养至 90%汇合时，使用 0.25%胰酶-EDTA消化，制备成单 细胞悬液，以每孔 2l06个的密度接种到 6 孔板上培养，此时记为零天（D0，以此类推）。b)D1 待细胞长至 80%-90%汇合，每孔换 2 ml 新鲜培养液，同时每孔加入 5 种病毒液（Oct4、Klf4、Sox2、C-myc、GFP)，每种病毒各 2 ml，置于培养箱中 37.5、5%CO2条件培养。c)D2 弃去培养液，每孔中加入 2 ml 新鲜培养液，同时每孔再加入 5 种病毒液（同前），每种 病毒各 2 ml，置于培养箱中 37.5、5%CO2条件培养。d)D3 弃去培养液，每孔加入 2 ml 新鲜ES 培养基按照 SN/T 2330、HG/T 3935执行，置于 培养箱中 37.5、5%CO2条件培养。e)D4 复苏饲养层细胞，于 100 mm 培养皿中培养。f)D5 将感染后的细胞用 0.25%胰酶EDTA消化，传至铺有饲养层的 100 mm 培养皿中，加入 9 ml ES培养液于37.5、5%CO2条件下培养。此后每天换一次培养液，于D10后换为条件性培养液培养。每日观察细胞变化，直至出现 ES 形态的细胞克隆。8.6 猪 iPSCs 的收集与传代培养 在体视显微镜下挑取形态较好，边界清晰的原代iPSCs克隆，使用玻璃针（制作见附录A.18）将其边缘与饲养层细胞分开，从一端轻轻地将克隆推起，将克隆吸出，轻轻吹打使其分散成若干较小的克隆，置于铺有饲养层的六孔板中扩大培养。8.7 猪iPSCs 的鉴定 8.7.1 碱性磷酸酶染色 用碱性磷酸酶染液对所获细胞克隆进行染色，阳性克隆呈紫红色或红色（见附录A.19）。8.7.2 免疫荧光染色分析 8.7.2.1 一抗孵育 克隆细胞经洗涤、固定、透化、封闭后，向各培养孔中分别加入200 l用1%BSA溶液以1:100的比例稀释的一抗（兔抗-Oct4:ab18976;兔抗-Nanog:ab80892、兔抗-Rex1:ab50828、鼠抗-SSEA-4:ab16287），放入培养箱中37孵育3 h；PBS洗涤3次，每次5 min。8.7.2.2 二抗孵育 将一抗溶液吸尽，PBS洗涤3次，每次5 min；每孔中加入200 l 用1%BSA溶液以1:400比例稀释的相应二抗（Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit、Alexa Fluor 568 goat anti-mouse），避光37孵育1.5 h。8.7.2.3,-二脒基-苯基吲哚（DAPI）染色 将二抗溶液吸尽，避光PBS洗涤3次，每次5 min。每孔中加入200 l DAPI染色液（D9542，40 mg/mL DAPI原液1:1000稀释于PBS中，避光），37避光孵育30 min。8.7.2.4 观察、拍照分析 DB22/T 23942015 5 将培养板置于荧光显微镜下观察、拍照分析。猪iPSCs克隆均呈Oct4、Nanog、Rex1阳性，为绿色荧光；也呈SSEA-4阳性，为橙色荧光。8.7.3 外源基因表达分析 8.7.3.1 总RNA 提取 使用1 mg/ml的IV型胶原酶将iPSCs克隆从饲养层上消化下来，将其与饲养层细胞分离，收集到无RNA酶1.5 ml离心管中Trizol法提取总RNA（见附录A.20）。8.7.3.2 RT-PCR 反应及分析 用BioRTcDNA第一链合成试剂盒获得cDNA；以该cDNA为模板，用目的基因特异性引物（Oct4:F-gtcgccagaagggcaaac,R-cagggtggtgaagtgaggg,125bp;Sox2:F-ccctgcagtacaactccatgac,-ggtgccctgctgcgagta,86bp;Klf4:F-cggcaaaacctacacgaagagt,R-agttcatctgagcgggcaaat,120bp;C-myc:F-ggattccgcctcgtt,R-tctccaagcatcactcg,185bp;Nanog:F-cttattcaggacagccctgattcttc,R-aagacggcctccaaatcactg,614bp）进行PCR反应，反应条件按试剂盒说明设定。凝胶电泳检查反应产物，获得各基因的相应大小的产物即证明所获猪iPSCs克隆表达上述外源基因（见附录A.20）。8.7.4 拟胚体检测 釆用悬滴法制备拟胚体，检测其体外发育能力（见附录A.21）。8.7.5 畸胎瘤检测 用皮下注射法将2l06的iPSCs注射到免疫缺陷的裸鼠皮下组织中，3周4周后手术取畸胎瘤组织，进行常规固定、脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色，观察三胚层分化发育情况（见附录A.22）。9 警示、标签及其他要求 9.1 警示要求 应按照GB 15562.2规定在液氮生物容器处悬挂或者安装警示牌。9.2 标签要求 应在细胞冻存管外粘贴标签，写明动物种类、组织名称、日期、冻存人等信息。9.3 其他要求 每月应专人定期往液氮生物容器中补充液氮，保持液氮量不少了容器的三分之一。DB22/T 23942015 6 A A 附 录 A（资料性附录）A.1 水 实验用水执行GB/T 6682。A.2 DMEM(dulbeccos modified eagle medium)和MEM(modified eagle medium)培养基 将一个包装的DMEM粉末溶于900 ml水中，加NaHCO3 3.7 g，定容至1 000 ml，调pH值至7.27.4，分装为90 ml/瓶，4保存备用。MEM配制同上。A.3 青-链霉素（100双抗）取青霉素0.5 g，硫酸链霉素0.5 g，溶于100 ml水中，分装为1 ml/管。临用前从冰箱中取出，每100 ml培养液或PBS中加1 ml。A.4 无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS）取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 2.1 g，KH2PO4 0.1 g，溶于1000 ml水中，调pH 7.27.4，分装后高压灭菌，室温保存备用。A.5 胰蛋白酶-EDTA（0.25%）取0.25 g胰蛋白酶，0.02 g EDTA-Na，溶于100ml PBS（pH 7.6）中，分装为5 ml/瓶。短期使用时，4 下保存。A.6 冻存液 80%MEM+10%小牛血清（NBS）+10%二甲基亚砜（DMSO）。A.7 丝裂霉素C 取2 ml DMEM注入丝裂酶素瓶中，充分溶解后吸出，注入20 ml DMEM中（50贮液），-20贮于暗处；使用时1 ml贮液+7.0 ml DMEM+2.0 ml NBS，每个 35 mm培养皿加入1 ml，浓度为10 g/ml。A.8 LB培养基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，溶于1L二蒸水中，pH7.3，1.034105 pa高压灭菌20 min。A.9 293 细胞培养基 DB22/T 23942015 7 DMEM+10%NBS+0.1 mM 非必需氨基酸+1.0 mM 丙酮酸钠+2 mM L-谷氨酰胺。A.10 转染培养基 293细胞培养基去掉血清。A.11 Opti-MEM 同DMEM的配制。A.12 ES培养基 DMEM+10 M-巯基乙醇+1%谷氨酰胺+0.1 mM 非必需氨基酸+30ng/ml干细胞因子（SCF）+20 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）+1000 U/ml 白血病抑制因子（LIF）+1.0 mM 丙酮酸钠+10%胎牛血清（FBS）。A.13 条件性培养液 将小鼠ES细胞以1:2比例在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传代培养。以后每48小时收集培养液1次,1000 r/min离心5 min,收集上清液,0.2 m孔径滤器过滤后冻存备用。A.14 IV型胶原酶 取胶原酶IV 100 mg，溶于100 ml DMEM+10%NBS+1%双抗中，分装为5 ml/瓶，短期使用时，保存于4冰箱。A.15 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备 从怀孕13 d的母鼠中无菌取出胎儿，去头、尾、四肢、内脏后用眼科剪剪碎，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，37.5、5%CO2下培养于含DMEM+10%NBS+1%双抗的培养液（M1）中。待细胞70%80%汇合时，弃旧液，加入1 ml丝裂酶素C，继续培养3 h4 h；取出培养皿，吸弃丝裂酶素C，用PBS液清洗45次，加入适量胰蛋白酶液，室温放置3 min5 min，在倒置显微镜下观察到细胞收缩，相互间出现明显界限时，加入2 ml新鲜M1终止消化；吹打成单细胞悬液，将细胞悬液移入一支10 ml离心管中，600 r/min离心3 min，弃上清；用M1再次洗涤细胞1次2次，调整细胞密度，将细胞悬液等份移入 35 mm培养皿或24孔培养板中，或制作成饲养层微滴（每滴75100 l，上覆矿物油），置37、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养待用。A.16 DH5 感受态细菌的制备及转化 从37培养了16 h17 h的平板培养基上挑取一个单个DH 5 菌落，接种到装有5 ml液体LB培养基的试管中，37振荡过夜；次日取50 l菌液接种于5 ml LB中，37振荡培养至OD值为0.60.8；取出试管，冰浴10 min，使培养物冷却到0；4下4 000 r/min离心2 min，弃上清；用2ml冰预冷的CaCl2-Tris-HCl悬浮细菌沉淀，置冰上25 min30 min，4下4 000 r/min离心2 min，弃上清；用0.5 DB22/T 23942015 8 ml0.8 ml冰预冷的CaCl2甘油溶液重悬细菌沉淀，即为感受态菌；每管0.1 ml分装到灭菌1.5 ml离心管中，现用或-70保存备用。转化时，从-70取出一支含100 l感受态菌的微量离心管，加入1 l 连接产物，冰浴30 min，42水浴热冲击2 min，冰浴5 min；加入1 ml 37预热的LB培养基（不含氨苄青霉素），37振荡培养1 h，4 000 r/min离心1 min，吸弃1 ml LB培养基，留下100 l LB培养基，吹打混匀后，涂布到含氨苄青霉素的LB平板固体培养基上，37培养12 h16 h，次日检查阳性菌落。A.17 质粒筛选、提取和浓缩 挑取单菌落接种于30 ml含50 g/ml 氨苄青霉素的LB中，37、250rpm摇床培养18 h；取25ml培养物接种于500ml含氨苄青霉素的LB中，37摇床培养16 h20 h；4、5 000 rpm离心10 min，收集菌体；将细菌沉淀重悬于10 ml 冰浴的溶液I（50 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L Tris-HC1+10 mmol/L EDTA）中；加20 ml溶液II（0.2 mol/L NaOH+1%SDS），轻轻颠倒数次混匀，冰浴10 min；加15 ml预冷的溶液III（5 mol/L乙酸钾60 ml+冰醋酸11.5 ml+一蒸水28.5 ml混匀），轻轻混匀，冰浴10 min，4、5 000 rpm离心10 min；取上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀后室温放置10 min；室温下10 000 rpm离心10 min，弃上清，敞开瓶口倒置离心瓶，弃尽上清；室温下用70%乙醇洗涤沉淀和管壁，在超净台内自然晾干或用真空装置使剩余乙醇尽量挥发；以适量TE（10 mmol/L Tris-HC1+1 mmol/L EDTA）溶解核酸沉淀，取3 l DNA用适当浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检查，其余于-20保存备用。A.18 猪iPSCs克隆的传代、培养 基本与ES细胞克隆的传代、培养相同。将iPSCs克隆以1:2比例培养于含ES培养基的胚胎成纤维细胞饲养层，每日观察，机械法用玻璃吸管挑取克隆传代培养。A.19 碱性磷酸酶染色 将细胞样品用适量4%多聚甲醛/PBS溶液室温固定15 min，用PBS冲洗后加入适量碱性磷酸酶作用液（2%巴比妥钠2 ml+3%-甘油磷酸钠2 ml+2%无水氯化钙4 ml+2%硫酸镁0.2 ml+蒸馏水1 ml，混匀后调pH 8.59.0），37下湿盒内孵育2 h；PBS洗35 min，加入2%硝酸钴溶液室温下作用5 min；PBS洗35 min，加入1%硫化氨溶液作用1 min；用流水洗净，立即拍照或用梯度酒精脱水后保存。A.20 RNA提取及RT-PCR RNA的提取用RNAiso Plus试剂盒进行。弃掉培养皿中的培养液，使用PBS轻轻漂洗2遍，加入1 ml RNAiso Plus反复吹打将细胞裂解；将液体转移至1ml无酶的离心管中，室温放置5 min；加入200 l预冷的氯仿剧烈震荡15 s，室温静置5 min；12 000 g 4下离心15 min，将上清400 l转移到新的无酶离心管中，注意不要碰到中间的蛋白层，加入400 l 异丙醇上下颠倒混匀；静置10 min，12 000 g 4离心10 min，去掉上清，加入1 ml 75%的酒精将沉淀重悬；12 000g 4离心5 min，去掉废液，将离心管倒置在滤纸上，去尽酒精，室温静置5 min左右；等沉淀干燥后，加入20 l DEPC水溶解沉淀，分装5 l到0.2 ml的离心管进行电泳，鉴定RNA质量，分装2 l到0.2 ml的离心管准备进行cDNA合成。cDNA合成使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒进行。RT-PCR反应体系（25 l）包括2 l cDNA、12.5 l SYBR green master mix、9.5 l 无RNA酶水、0.5 l的上下游引物；反应条件如下：95预变性3 min，PCR循环数40(95 20s，55 45s，72 1min)，72延伸5 min。每个样品三次重复。DB22/T 23942015 9 A.21 拟胚体检测 用ES完全培养液在T25培养瓶中培养iPSCs克隆，当克隆长满时，弃培养液，使用PBS轻轻漂洗克隆3遍，然后每个T25的培养瓶中加入2 ml 胶原酶IV，在5%CO2、37.8下消化15 min，在显微镜下观察克隆形态，当克隆的边缘轻轻卷起时，轻轻震荡培养瓶，使克隆与饲养层细胞脱离，将培养液转移至15 ml离心管中，水平离心机1200rpm 离心10 min后，弃上清，加入1 ml 胰酶替代物于37水浴中消化90s，然后轻轻将克隆吹打成单细胞悬液，水平离心机离心10 min，使用ES完全培养基制备成单细胞悬液，进行细胞计数后稀释为 1.5106/ml，将细胞悬液以每20 l/滴的量滴于60 mm培养皿盖上，向培养皿中加入5 ml PBS，轻轻将皿盖反转过来扣于皿底上，小心将培养皿送入培养箱中，勿使微滴掉落或融合，37.5、5%CO2条件培养72 h。然后将拟胚体收集观察其分化情况。A.22 畸胎瘤检测 按A.21培养、分离iPSCs克隆，消化后获得单细胞悬液，调整细胞密度至107个/ml，再用胰岛注射针将iPSCs细胞悬液皮下注射入裸鼠四个腋下以及肾囊中，正常饲养管理，观察裸鼠中畸胎瘤形成情况，3周4周后瘤体中如能形成内、中、外三胚层的组织，即可证明被注射细胞具有三胚层分化能力。DB22/T 23942015 10 参 考 文 献 1 Nagy,A,Gertsenstein,M,Vintersten,K 著.孙青原，陈大元主译.小鼠胚胎操作实验手册，第三版，化学工业出版社，北京，2006.2 薛庆善 主编.体外培养的原理与技术.科学出版社.北京，2001.3 F 奥斯伯，R 布伦特，RE 金斯顿,等.精编分子生物学实验指南.严子颖，王海林译.北京：科学出版社，1998._