桃树根癌病综合防治技术规程DB11／T 1431-2017.pdf

ICS 65.020 B 16 DB11 北京市地方标准 DB11/T 1431 2017 桃树根癌病综合防治技术规程 Technical regulations for control of peach crown gall(Agrobacterium tumefaciens)2017-06-29发布 2017-10-01实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 1431 2017 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 病情分级.1 5 防治措施.2 5.1育苗期预防措施.2 5.2苗木选择与定植.2 5.3 田间管理.2 5.4 药剂防治.2 6 育苗期预防效果调查.2 附 录 A（资料性附录）症状特征.3 附 录 B（资料性附录）发病规律.4 附 录 C（资料性附录）检测方法.5 参考文献.7 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 相关规则起草。本标准由北京市园林绿化局提出并归口。本标准由北京市园林绿化局组织实施。本标准起草单位：北京市林业保 护站、中国农 业 大学。本标准参与起草单位：北京 流村王 园果园。本标准 主要 起草 人：王合、米莹、郭岩彬、王建辉、周在豹、杜金萍、龚硕、张崇岭、卢绪利、吴有刚、王永明、王睿琦、赵连祥。DB11/T 1431 2017 1 桃树根癌病综合防治技术规程 1 范围 本标准规定 了桃树根癌 病病情分级、防治措施和育苗期防治效果调查。本标准 适 用 于 北京 地区桃树根癌 病 的 防治，樱桃、樱花等 植 物根癌 病 的 防治 可 参照 执行。2 规范性引用文件 下列 文件 对于 本文件 的应 用 是必不可少的。凡是注日 期 的 引用文件，仅所注日 期 的版 本 适 用 于 本文件。凡是不注日 期 的 引用文件，其最新版 本（包括所有的修改 单）适 用 于 本文件。GB/T 8321.9 农 药 合 理 使 用准则（九）NY/T 2725 氯 化 苦土壤消毒技 术规 程 3 术语和定义 下列 术语和定义 适 用 于 本文件。3.1 桃树根癌病 peach crown gall 又称 桃树 冠瘿 病、桃树根 瘤 病，是 一种细菌 性病 害，在根 颈 和 根 部产生肿瘤，导致 树 势衰弱，甚至死亡。3.2 桃树根癌病病原菌 pathogenic bacterium of peach crown gall 引起 桃树根癌 病 的 病 原菌，为 根癌土壤 杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。3.3 抗根癌菌剂 root carcinoma bacteria resistance agent 对根癌 病 菌具 有 良好拮抗作 用 的 微生 物 制 剂。4 病情分级 按 肿瘤 发 生部 位 将 病情分 为 5级，分级标准 如 下：0级：植 株无肿瘤；1级：肿瘤 发 生 在 须 根 上；2级：肿瘤 发 生 在 侧 根 上；3级：肿瘤 发 生 在 侧 根 与 主根的连 接处；4 级：肿瘤 发 生 在主根、根 颈或枝干上。DB11/T 1431 2017 2 桃树根癌 病症状特征参 见 附录 A，发病规律参 见 附录 B，检测方法参 见 附录 C。5 防治措施 5.1育苗期预防措施 5.1.1 苗圃地选择 选择 非 发病 地 块作为 育苗 地，避免 在 前 茬为豆类、蔬菜以及 林 地、林业苗 圃 等地 块 育苗；必要 时 可对 育苗 地 进 行土壤 熏蒸处 理,按 GB/T 8321.9和 NY/T 2725相关规定 执行。5.1.2砧木种子处理 选择 抗 病 的适 宜砧 木 种子，播种 前，用 抗 根癌 菌 剂 拌种处 理。5.1.3 苗木嫁接 采 用 高 位 芽接 法 嫁接，避免接 口与 土壤 接触；嫁接 前，使 用 75%酒精 对 嫁接工具进 行消毒 处 理。5.1.4 苗木出圃 对 病情 为 1级、2级 的 苗木 剪除肿瘤，剪除 的 肿瘤及时销毁；对 病情 为 3级、4级 的 苗木 及时销毁。5.2苗木选择与定植 5.2.1对 无 症状苗木 及剪除肿瘤 的 1级、2级苗木 进 行 蘸 根 处 理并 及时 定植。5.2.2定植前，将抗 根癌 菌 剂 放入陶瓷、塑 料 等 非 金 属容器 中，加水，按 1:1调 匀成 糊 状，将剪 根 后 的桃 苗 浸 入菌 液 中，浸 入 深度超过 根 颈上部 5cm，即 可 拿 出 栽 植，随浸随栽。5.3 田间管理 5.3.1对于 碱 性 土壤的 果园，适 当增 施 酸 性 肥 料、有 机肥 和果 树 专 用 肥 料。5.3.2 减 少 果园 土壤 清耕 等 栽培 管理措施 以及 蛴螬、蝼蛄 等地下 害 虫 对根 系 的 伤 害。5.3.3 将 大 水 漫灌、串灌 改 为一 树 一 畦 的 单 株 灌溉 或 滴灌。5.4 药剂防治 对 已 发病 株及时 切 下 肿瘤，用 抗 根癌 菌 剂 等 药剂 涂抹伤 口，切 下的 病 瘤 随即 销毁。6 育苗期预防效果调查 苗木出 圃时，调查 使 用 抗 根癌 菌 剂和 其 它 处 理 的 苗木发病 等 级，计算 防治效果。病情 指数 与防治效 果分 别 按 式（1）、（2）计算：病情 指数=4 调查 总 株 数 级 数值 相 对 病 株 数 各 级 100(1)防治效果=对 照 的 病情 指数 的 病情 指数 对 照 的 病情 指数 处 理 100%(2)DB11/T 1431 2017 3 附 录 A（资料性附录）症状特征 A.1 地下部分症状 桃树根癌 病 主要 发 生 在根 颈部 和 根 部，包括 侧 根 和 须 根，树 干上 偶 见。根 部 被 害 后通常形 成 球形、扁球形 或 不 规则 的 肿瘤。初 生瘤 乳白色 或 略带红色，光滑，柔软，后逐渐变褐色乃 至 深褐色，木 质 化 而 坚硬，表面粗糙 或 凹凸 不 平，龟裂，表面 细 胞枯 死，内 部 木 质 化，并 在 瘤 的周 围 或 表面 产生一 些 细 根。最 后外皮 脱落，露 出 许多突 起状 小 木 瘤，瘤 的 内 部 组织 紊乱 并 混 有 薄壁 组织 及 维 管 束，在 较 大的根 瘤上还会 出 现许多小 瘤。肿瘤 的 数 目 少的 1 2个，多 的 达 10余个，直径差异很 大，小 如豆 粒，大 如 胡 桃 和拳头，甚至 直径达 数 十厘 米。A.2 地上部分症状 苗木和 新 植 幼龄 桃树 受 害 后，发育 受阻，生 长缓慢，植 株 矮小，严重 时 叶片黄 化，早 衰。成 年 果 树受 害 后，生 长 不 良，果实 小，甚至 全 株死亡。DB11/T 1431 2017 4 A A 附 录 B（资料性附录）发病规律 B.1 病原菌的越 冬 病 原菌 在癌 瘤 组织 的 皮 层 内 或 在癌 瘤 破 裂 脱 皮 时进入 土壤中 越冬，细菌 在土壤中 能存活多年。B.2病原菌的 侵入途径 病 菌 通过 嫁接、昆 虫 或 人 为 因素造 成 的 伤 口 侵 入 植 株。B.3病原菌的 传播 雨 水 和 灌溉 水 是 自然传 播 的主要 方 式，苗木 带 菌 是 远距离传 播 的 重 要 途径。B.4 发病 条 件 B.4.1 温度湿度 病 菌 侵染 与发病 需 要 一 定 的 湿 度 和 温 度，太低太 高 均 不利于 病 害 发 生。当 旬气温达到 20 23.5，地 温 18 20 以及 土壤 和 水 质 偏 碱 时，均 有利于 该 病 菌 的 侵染 为害。B.4.2 土壤 理 化 性质 碱 性 土壤有利于 发病,土壤 pH值 在 6.2 8时 均能 保 持 病 菌 的 致 病 力。偏 碱 性 的土壤 和 湿 度 大的 沙 壤土 内 发 生 重，酸 性和 粘重 的土壤中 很 少 发病。B.4.3 嫁接方 式 嫁接 口 的 部 位、接 口 大 小 及 愈 合的 快慢均能影响 发病 程 度。在 苗 圃 中，嫁接 口与 土壤 接触时 间 长，染 病 机 会多，发病 率 高。DB11/T 1431 2017 5 附 录 C（资料性附录）检测 方 法 C.1 致 病性 检测 C.1.1 致 病菌分 离 取 新 鲜 的 冠瘿瘤，用 2%的 次 氯 酸 钠 表面 消毒 2min，再 用 70%乙醇 表面 消毒 90s，无菌生 理 盐 水 清 洗 35遍，用 无菌剪 刀 将冠瘿瘤剪 切 成 0.5cm的 小 块，加入 2 5倍体积 的 无菌生 理 盐 水，匀 浆 后，取 上 清，涂 板 到 土壤 杆菌 选择性 培 养基 MW培 养基 上，28 下 培 养 48h 72h。MW培 养基：每升 培 养基 中 含 有 甘 露 醇，10.0 g；K2HPO4，0.3 g；生 物 素，100 g；NaNO3，5.0 g；NaCl，0.2 g；MgSO4 7H2O，0.1 g；0.1%结晶紫，2.0ml；0.1%Fe-EDTA，2.0 ml；琼脂，15g 20g。pH，7.0 7.2；121 高 压灭 菌 30 min。C.1.2 致 病性 检测 取 分 离 的 单 菌 落，接种 到 LB培 养基 上 培 养 48h。将 待 测 菌 液 配 制成 浓 度 为 108 CFU/ml的 菌 悬 液(OD600为 0.6)。用 灭 菌接种 针 在 生 长 7d 10d的 向 日 葵茎段 上 刺 数 下 造 成 伤 口，吸 取 5 l 10 l 待 测 菌 液滴 到 无菌 棉 球 上 后 放 置 于 伤 口 上，以 封 口 膜 包 裹 伤 口，温 室 内培 养 15 d后 观察结 瘤 情 况，形 成肿瘤 的 为 发病。C.2冠瘿碱 的 检测 方 法 C.2.1检测 用 试 剂 电泳 检测 缓 冲 液：按照 甲 酸:乙 酸:水为 5:15:80的 比例配比。荧 光 染 液：为 菲醌-乙醇溶 液，由 0.02%菲醌-无水 乙醇 和 10%氢氧 化 钠/60%乙醇溶 液 按照 1：1混 合。检测用标准 样品：胭脂 碱、章鱼 碱 标准 样品，精 氨 酸 标准 样品。C.2.2 检测 方 法 取 植 物 肿瘤 组织 1g 2g放入 离 心 管，用 解剖针挤压 出 汁 液，离 心，用 毛 细 管 取 上 清，点 到 滤纸 上，同 时 点胭脂 碱、章鱼 碱 和 精 氨 酸 标准 样品。在 甲 酸:乙 酸:水=5:15:80溶 液 中 电泳 1.5h，电泳电压 为 400V，烘 干 滤纸，用 菲醌-乙醇 染 液 染 色，在 紫 外 灯 下 观 测 荧 光 斑点，与标准 样品比 较，含 有 胭脂 碱 或 者章鱼碱 的 为 发病。C.3 核酸检测 C.3.1 选 取待检测 的病菌 采 用 根癌土壤 杆菌 选择性 培 养基 分 离 土壤 细菌，选 取 单 菌 落 利 用 PCR的 方法 快 速 检测 致 病性 根癌土壤 杆菌。C.3.2 聚 合 酶链式反应（PCR）检测致 病性特 异 性引 物 PCR 的 引 物 为 iaaHF2（5 ACATGCATGAGTTATCGTTTGGAAT3）/iaaHR1（5 GCATCAAGGTCATCGTAAAAGTAGGT3）；iaaH-F10（5GGAAACATGCATGAGTTATCGTT3）/iaaH-R10（5CCACATCAGCATCAAGGTCATC3）。DB11/T 1431 2017 6 C.3.3 聚 合 酶链式反应（PCR）检测致 病性 反应体系 PCR的 反 应 体 系 为:10 Buffer 2.5 ml dNTP(10mM)1.0 ml 菌 液(10ng/ml)1.0 ml iaaHF2(10mM)或 iaaH-F10 0.25 ml iaaHR1(10mM)或 iaaH-R10 0.25 ml TaqDNA酶(5U/ml)0.2 ml ddH2O 19.8 ml total 25.0 ml C.3.4 聚 合 酶链式反应（PCR）检测致 病性 反应 程 序 PCR反 应程 序 如 下：94 5 min 94 40 s 54 40 s 72 90 s 72 10 min 4 保 存 C.3.5 核酸检测 的 结 果 配 制 1%浓 度 的 琼脂糖凝胶，凝胶电泳 检测，iaaHF2/iaaHR1引 物 能 够扩 增，电泳 检测 为 420 bp 的 DNA条 带 为致 病性 阳 性；iaaH-F10/iaaH-R10引 物 能 够扩 增，电泳 检测 为 424 bp 的 DNA条 带 可 以进一 步确 定 致 病性 为 阳 性；两条 特 异 性引 物 菌无 法 扩 增 出 条 带 的 为致 病性 阴 性。35 cycles DB11/T 1431 2017 7 参 考 文 献 1 GB 8370 1987 苹 果苗木 产 地 检 疫 规 程.2 NY/T 5114 2002 无 公 害 食 品 桃 生产 技 术规 程.3 马德钦，王 慧敏.果 树根癌 病 及 其 生 物 防治 J.中国 果 树,1995,(2):42-44.4 李健强，王 慧敏，张 桂火 等.一 些 杀 菌 剂和 抗菌 素 对根癌 菌 和 根癌 抑 制菌 的 作 用 J.中国农 业大学学 报,1996,(3):74-78.5 王 慧敏.植 物根癌 病 的 发 生 特 点 与防治 对 策 J.世界 农 业,2000,(7):28-30.6 刘焕芳，段 成 国，陈 学 森 等.核 果 类 果 树根癌 病 菌 寄 主 范围 及抗 性 研究 初 报 J.北方果树,2002,(5):4-7.7 陶 万强，邢彦峰，王合等.桃树根癌 病防治 技 术 J.中国 果 树,2004,(2):46-47.8 罗 维 德，杨 金 兰，杨 永 启.桃树根癌 病防治 技 术 探讨 J.中国 植保 导 刊,2004,(3):13-17.9 田 国 忠，李 永，朱 水 芳 等.我 国 木本植 物 致 病性 土壤 杆菌 的 分 子 检测和 比 较 鉴 定 J.林业 科学,2006,(2):63-72.10 罗正 均，淮稳霞，赵 文 霞 等.我 国 木本植 物根癌 病检 疫 与防治 问题思 考 J.林业 科 技 开 发树,2011,(4):6-11.11 付丽，范 昆，曲健禄 等.樱桃根癌 病 的 研究 进 展 J.落叶 果 树,2015,(2):19-21.12 Bini F,Kuczmog A,Putnoky P,et al.Novel 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