莱姆病螺旋体的检测 荧光PCR法DB22／T 1673-2012.pdf

ICS 11.020 C 62 备案号：35806-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1673 2012 莱姆病螺旋体的检测 荧光 PCR法 Detection of Borrelia burgdorfe Fluorescence PCR 2012 12 17发布 2013 01 01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1673 2012 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009、GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：刘阳、王玮琳、丁旭、孙舒、刘韬、刘金华、牛茜、罗雁非、郑旭。DB22/T 1673 2012 1 莱姆病螺旋体的检测 荧光 PCR法 警告为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处 置，并按 GB/T 19489中的有关规定执行。1 范围 本标准规定了莱姆病螺旋体荧光 PCR检测方法 本标准适用于莱姆病螺旋体的实验室检测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其 最新 版本（包括 所 有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分析 实验室用 水 规 格和 实验方法 GB/T 19489 实验室 生物安全 通用要 求 3 缩略语 下列 缩略语 适用于本文件。PCR:聚合酶链反应（Polymerase chain reaction）。DNA:脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）。Taq酶:DNA聚合酶。FAM:6-羧基-荧光 素（一种 荧光 报告基团）（6-carboxy-fluorescein）。MGB:小沟结合物（一种 荧光 淬灭基团）(Minor groove binder)。SDS:十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate)。CTAB:十六烷基三乙基溴化铵（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide）。TE:缓冲液(Tris-Cl EDTA)。Tm值:核酸融解温度（Melting tempreture）。Ct值:每个反应管内 的荧光 信号量达到设 定的 阈值时 所 经历 的 循环数(Cycle threshold)。4 原理 实 时 荧光 PCR方法，是 在 PCR反应 体 系 中 加 入荧光 基团，利 用荧光 信号积累，实 时监 测 整个 PCR进程，最后 通过荧光 信号 的 增幅情 况来判 定 反应结 果。PCR反应 体 系 中 加 入 一 对 引 物 的 同 时加 入 一 条 特异性 荧 光 探针，探针两端 分 别 标 记 荧光 报告基团和 荧光 淬灭基团，PCR扩 增时，利 用 Taq酶 的 水解 作 用，使探针上 的荧光 报告基团 远离 淬灭基团 而 发 出荧光 信号，荧光检测 系 统可接收 到 荧光 信号，此 方法检测的是 积 累 荧光。MGB探针（Minorgroove binder oligodeoxynucleotide conjugate,MGB-ODN)，5端 标 记 FAM荧光 素 为 报告基团，3端采 用了非荧光 性 的 淬灭基团，吸收 报告基团 的 能 量后 并不 发 光，降低 了本 底 信号 的 干扰。此外，MGB探针 的 3端还连接 了 一个二 氢 环化 吲哚卟啉-三 肽(Dehydrocyclopyrroindole tripetide,DPI3)，可以稳 定 探针与模板 的 杂交,升高探针 Tm 值,使较短 的 探针同样能 达到 较高 的 Tm值。DB22/T 1673 2012 2 5 试剂与材料 除另 有 说明以外，所用 试剂均 为 分析 纯或 生化 试剂，所用 水 为 符 合 GB/T 6682 中规定的 二 级 水。5.1 试剂配制 见附录 A。5.2 引物 及探针 上游 引 物：5 GCTGTAAACGATGCACACTTGGT-3 下 游 引 物：5-GGCGGCACACTTAACACGTTAG-3 探针：6-FAM-TTCGGTACTAACTTTTAGTTAA-MGBNFQ 5.3 质 控品 空白对照：以 水 代替 DNA模板。阴性对照：非 目 标 菌 的 DNA作 为荧光 PCR反应 的 模板。阳 性对照：莱姆病螺旋体标准 株 ATCC 35210 DNA作 为荧光 PCR反应 的 模板。6 仪器设 备 6.1 荧光定 量 PCR仪。6.2 生物安全 柜。6.3 高压 灭 菌锅。6.4 高速台式冷冻离 心 机：离 心 速 度 12000 r/min以上。6.5 组织匀浆仪。6.6 涡 旋 混 合 器。6.7 低 温 冰箱（-80）、冷 藏 冷冻 冰箱（2 8 和-20）。6.8 微 量 可 调移 液 器（2.5 L、10 L、100 L、1000 L）。6.9 恒 温水 浴箱：室 温 100。6.10 微 量 离 心 管：1.5 mL。7 试 样 制备 7.1 蜱 取 单 只活蜱,用 70%乙 醇浸泡,生 理盐 水 清洗 3次,滤纸 吸干 后。将 单 只蜱放 入 1.5 mL离 心 管 中，加 入500 L TE缓冲液，用 匀浆仪 研碎。匀浆 液 10000 r/min,离 心 2 min，弃 上 清，沉淀备 用。7.2 血液 500 L EDTA抗凝血 液 中 加 入 1 mL无 菌 水,5000 r/min,离 心 2min，弃 上 清，沉淀备 用。新 鲜血 样 品如 不 能 立即 用于 抽 提 DNA,可 置 于 4 保存,但 不要 超 过 2个 月,欲长 期 储存,分 装-20 储存。7.3 组织 DB22/T 1673 2012 3 25 mg 30 mg动 物 组织(新 鲜 或冷冻组织均可),放 入 1.5 mL离 心 管 中,加 入 500 L TE缓冲液,用匀浆仪 研碎。匀浆 液 10000 r/min,离 心 2min，弃 上 清，沉淀备 用。8 检测 程序 8.1 样品 DNA提取 在 上 述 样 品沉淀 中 加 入 560 L TE缓冲液，反 复吹打 使 之重悬，加 入 30 L的 10%SDS和 3 L蛋 白 酶 K（20 mg/mL），混 匀，37 孵育 1h；加 入 100 L 5 mol/L NaCl,充 分 混 匀，再 加 入 80 L CTAB/NaCl溶 液，混 匀，65 温 育 10 min；加 入 等 体 积 的 氯仿/异 戊醇，混 匀，12000 r/min 离 心 5 min，将 上 清转 入 一新 离 心 管 中；加 入 0.6倍 体 积 异 丙醇，轻轻混 合 直 到 DNA沉淀 下 来，10000 r/min 离 心 15 min,去上 清；75%乙 醇洗 一 次，去 上 清，干 燥，加 入 50 L的 TE缓冲液 溶 解 DNA备 用（如 不 能 及 时 检验，可 将 上 清 液 于-20 保存；-70 可 长 期 保存）。也 可使 用 商业 化 的 DNA提 取 试剂 盒 提 取。8.2 荧光 PCR检测 反应 体 系 总 体 积 为 25 L，其中 含：TaqMan Mix缓冲液 12.5 L、引 物（10 mol/L）各 1 L、探针（5 mol/L）1 L、模板 DNA 5 L、水 4.5 L。将 加 样 后 的 PCR管 放 入荧光 PCR仪 内，记录样 本 摆放顺序。反应 参 数设 置如 下：第 一 阶段，50 2min；第 二 阶段，92 10min；第 三 阶段，95 15 s、63 60 s，50个循环；荧光 收 集 设 置 在 第 三 阶段 63 60 s时进行。不 同仪 器、不 同 Taq DNA聚合酶 可 根 据要 求 将 反应 条件 做 适 当 调 整。9 结果判 定 及报 告 9.1 结果分析条 件 设 定 直 接 读 取 检测 结 果。阈值设 定 原 则 根 据 仪 器 噪声 情 况 进 行 调 整，以 阈值 线刚好 超 过 正常 阴性样 品 扩 增 曲线 的 最 高 点 为准。9.2 质 控 标准 9.2.1 检验过 程 中 分 别 设 空白对照、阴性对照、阳 性对照。9.2.2 空白对照、阴性对照 无 Ct值，并 且 无 扩 增 曲线。9.2.3 阳 性对照 的 Ct值应小 于 35.0，并出 现典型 的 扩 增 曲线。否 则，此 次 实验 视 为 无 效。9.3 结果描述及判 定 9.3.1 阴 性 无 Ct值 并 且 无 扩 增 曲线，报告 莱姆病螺旋体 核酸 检测 结 果阴性。9.3.2 阳 性 Ct值小 于 或 等 于 35.0时，报告 莱姆病螺旋体 核酸 检测 结 果 阳 性。DB22/T 1673 2012 4 9.3.3 有 效 原 则 检验 样 本 Ct值 大 于 35.0且 小 于 40.0时，建议 重复 检测 一 次，如 果 Ct值 仍 小 于 40.0，且曲线 有 明 显的 对 数增 长 期，可 报告 莱姆病螺旋体 核酸 检测 结 果 阳 性，否 则为 阴性。10 废 弃 物处理 检验过 程 中的 废 弃 物，收 集 后进 行 高压 蒸汽 灭 菌 处 理 或 其 他 等 效 的 处 理 方法。DB22/T 1673 2012 5 A A 附 录 A（规范性 附录）试剂配制 A.1 10%SDS 在 900 ml水 中 溶 解 100 g电泳 级 SDS，加 热至 68 助 溶，加 入 几滴浓 盐 酸 调 节 溶 液 的 pH值 至 7.2，加水 定 容至 1 L，分 装备 用。A.2 20 mg/ml蛋白酶 K 将 200 mg的 蛋 白 酶 K加 入 到 9.5 ml水 中，轻轻 摇 动，直 至 蛋 白 酶 K完 全 溶 解。不要 涡 旋 混 合。加水 定容 到 10 ml，然 后分 装 成 小 份贮 存 于-20。A.3 CTAB/NaCl溶液 在 80 mL水 中 溶 解 4.1 gNaCl，缓 慢 加 入 10 g CTAB，同 时加 热 并 搅拌，如 果 需 要，可 加 热至 65 使其 溶 解，定 容终 体 积 至 100 mL。A.4 10 TE缓冲液(pH 8.0)量 取 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)25 mL,0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)1mL,置 于 100 mL烧杯 中。向烧 杯 中 加 入 约 40 mL的 去 离 子 水，混 合 均匀，定 容至 50 mL后，高压 灭 菌 备 用。A.5 0.5 mol/L EDTA 在 800mL水 中 加 入 186.1g二水乙二 胺四 乙酸二钠（EDTA-Na2 2H2O），在 磁力搅拌 器 上 剧烈搅拌，用 NaOH调 节 溶 液 的 pH值 至 8.0（约需 20g NaOH颗粒）然 后 定 容至 1 L，分 装 后 高压 灭 菌 备 用。_