鸡传染性喉气管炎PCR检测技术规程DB34／T 1940-2013.pdf

ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 19402013 鸡传染性喉气管炎 PCR 检测技术规程 Technical regulation for detection of Chicken Infectious Laryngotracheitis by PCR 2013-08-28 发布 2013-09-28 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 19402013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省农业委员会提出。本标准起草单位：安徽农业大学动物科技学院、安徽省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人:王桂军、朱良强、耿照玉、占松鹤、汪彤、江定丰、魏建忠、潘玲、陈静、何长生、杨德康、栗新、吴保谊。DB34/T 19402013 1 鸡传染性喉气管炎PCR检测技术规程 1 范围 本标准规定了应用聚合酶链反应（PCR）方法检测鸡传染性喉气管炎，包括样品的采集、样品处理、试验材料、操作程序和结果判定等。本标准适用于临床鸡传染性喉气管炎的检测和诊断。2 试验材料 2.1 特异性引物 根据 ILTV 的 TK 基因序列设计了一对引物，序列为：上游引物 A1：5-GGG AAA CTT GAA TGT CGG GAG-3,下游引物 A2：5-TGG ATT ATA CGC CGT GCC TGT-3，扩增 DNA 片段大小为 329 bp，引物的使用浓度为 50 mmol/L。2.2 试剂 2.2.1 DNA提取试剂 DNA 提取试剂如下：消化缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0；10 SDS；20 mg/Ml 蛋白酶K；苯酚；氯仿；无水乙醇；75乙醇；2.2.2 PCR试剂 PCR 试剂如下：2Taq PCR MsaterMix 试剂；特异性引物；阳性对照：ILT活疫苗（含鸡传染性喉气管炎 K317株病毒）2.2.3 电泳试剂 电泳试剂如下：溴化乙锭；琼脂糖：电泳级；DB34/T 19402013 2 电泳缓冲液 2.2.4 其他试剂 其他试剂如下：灭菌双蒸水；1 mol/L（灭菌）PBS：pH 7.2。2.3 仪器设备及耗材 2.3.1 仪器设备 本方法使用下列仪器设备：PCR仪；电泳仪；电泳槽；紫外光透射仪；凝胶成像系统；小型高速离心机；水浴锅；旋涡振荡器；乳钵或玻璃研磨器；微量加样器：100 L1000 L、20 L200 L、5 L50 L 和 1 L10 L 等多种规格。2.3.2 一次性耗材 本方法使用下列一次性耗材：离心管（PP材质）：1.5 mL；PCR反应管（PP材质）：0.2 mL；吸头：1 000 L、200 L、10 L 等多种规格。3 操作程序 3.1 喉头、气管组织样品的处理 无菌采取发病鸡的喉头、器官组织样品，置于灭菌乳钵中剪碎，充分研磨，用灭菌 PBS 溶液配成 15 乳悬液,反复冻融 3 次。以 5 000r/min 离心 5 min，收集上清液，供 DNA 提取或置-20保存备用。3.2 待检样品DNA提取 3.2.1 喉头、气管组织样品DNA提取 取处理好的样品 250 L 于 1.5 mL 离心管中，每管加 400 L 消化缓冲液（500 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl，1 SDS），加蛋白酶 K 至终浓度 100 g/mL，混匀；50水浴 1 h。从水浴中取出消化后样品，每管加入饱和苯酚 600 L，充分震荡摇匀，12000 r/min 离心 10 min；取上清液约 400 L，分别加入 200 L 饱和苯酚和 200 L 氯仿溶液，震荡摇匀，12000 r/min 离心 10 min；取上清液再加入 2.5 倍体积无水乙醇，摇匀后置-20沉淀 30 min；10000 r/min 离心 10 min，DB34/T 19402013 3 弃去上清液，加入 1 mL 75的酒精洗涤沉淀一次，将所得核酸沉淀物放在 42烘箱内烘干或室温放置自然晾干；每管中加入 30 L TE 或灭菌双蒸水。获得的DNA 样品可直接进行 PCR 反应或置-20保存备用。3.3 PCR检测 在冰浴条件下，按下列试剂用量在 PCR 反应管中分别加入各成分：2PCRTaqMix 酶 12.5 L 50 mmol/LILV检测上下游引物（A1 和 A2）：各 1 L，终浓度为 1 mmol/L；待检样品DNA：5 L；灭菌双蒸水：补足至总体积为 25 L。加完试剂后瞬时离心混匀。将 PCR 反应管置于 PCR 仪内，按如下程序进行PCR反应：94预变性 3 min 后,进入循环 94变性15 s,53退火30 s,72延伸 30 s,30 个循环后,72延伸 10 min。PCR 产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置4保存备用。3.4 阳性及阴性对照 3.4.1 阳性对照 用 ILT 活疫苗（含鸡传染性喉气管炎 K317 株病毒）作为阳性对照。3.4.2 阴性对照 用灭菌双蒸水作为阴性对照。3.5 电泳 3.5.1 制备1.0琼脂糖凝胶板。3.5.2 取5L PCR产物，与0.5L加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。3.5.3 加入分子量标准DNA Marker。3.5.4 盖好电泳仪，插好电极，将电压调至 90V 左右电泳，3040min。3.5.5 取出凝胶，置于紫外凝胶成像仪系统扫描、拍照。3.5.6 以DNA Marker为参照分子量标准，判断 PCR 扩增片段大小。4 结果判定 将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外光透射仪上观察，与标准 DNA 分子量比较，分析结果，然后可用凝胶成像系统拍照保存。若待检样品在 329 bp 左右的位置出现一条特异性 DNA 条带，且与阳性对照的 DNA 条带位置一致，则判定为鸡传染性喉气管炎阳性。A _