甘蔗DNA指纹图谱采集技术规程DB45／T 2026-2019.pdf

ICS 65.0 20.01 B 61 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 20262019 甘蔗 DNA 指纹图谱采集技术规程 Technical regulations for the collection of sugarcane DNA fingerprint 2019-12-05 发布 2019-12-30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布 DB 45/T 2 02 6 20 19 I 前 言 本标准按照G B/T 1.12 0 09给出的规 则起草。本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并宣贯监督。本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所。本标准起草人：高轶静、周会、杨荣仲、熊发前、段维兴、张保青、杨翠芳、周珊、王泽平、张革 民。DB 45/T 2 02 6 20 19 1 甘蔗 DNA 指纹图谱采集技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗DN A指 纹图谱采集的术语和定义、原理、仪器设备、操作程序及数据采集。本标准适用于广西壮族自治区范围内保育和推广的甘蔗品系、品种、杂 交种以及甘蔗种质资源的DN A 指纹图谱的采集。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2.1 简单重复序列 s im pl e s eq ue nc e rep ea t（SS R）一类由几个核苷酸（一般为25个）为重复单位组成的简单串联重复序列。根据其保守的边界序列 设计引物，可通过PC R、电泳技术分析重复序列的重复次数变异。2.2 核心引物组合 c or e pri me r co mb ina ti on 指品种DN A指 纹鉴定优先选用的一套S SR引物，具 有多态性高、重复性好、稳定性高、电泳峰易区 分 等综合特性，作为统一 用于品种DNA 指纹数据采 集和品种鉴 定的引物，以保证不同 实验室数据 具有可比 性。2.3 参照品种 referenc e var iety 对应于特定位点不同等位变异的一组品种，用于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段 的大小，校正仪器设备的系统误差，以保证不同实验数据具有可比性。本标准选择广西壮族自治区范围 内的主栽品种之一RO C2 2 和重要亲本桂糖11号作 为参照品种。3 原理 由于不同甘蔗的基因组D NA存在简单 重复序列的重复次数差异，这种差异可采用PC R扩 增和电泳检测 获得的DN A指 纹对不同品种加以区分。4 仪器设备和试剂配制 仪器设备和试剂配制方法见附录A。5 操作程序 DB 45/T 2 02 6 20 19 2 5.1 样品准备 每份样品至 少 采集 两批，每 批 采集 的样品 均包 括 参照品种ROC 22和桂糖1 1号；单次采 集的样品 独立进行 实验，作为一次重复。5.2 D NA 提取 取嫩叶 组 织约 0.2 g，迅 速剪碎，放入 盛 有 液氮 的研 钵进行充 分研 磨后置 于 离心管中，加 入 1 mL 预热 至 6 5 的D NA提 取液，6 5 水浴3 0 mi n，期间轻缓颠倒混匀 2次；12 00 0 r pm离心 20 mi n，吸取 上 层清液 至2 m L离心管，加 入 等 体积 的 酚:氯仿:异 戊醇混 合 液（25:2 4:1），轻缓颠倒 混匀，1 2 00 0 rp m离心 10 min，取 上 清液转入新 的2 mL离心管，再 加 入 等 体积氯仿 重复 抽 提一次，吸取 上 清液 至 新 的2 mL离心管；加 入 等 体积 异 丙醇，-20 静 置 10 mi n，1 2 00 0 rp m离心 10 mi n，弃 上 清液，7 0%酒 精洗涤 2次。常温干燥后 加 入 10 0 L T E溶 解，-20 保存。DN A质 量经 OD 2 6 0/2 8 0检测在 1.8 2.0之 间 方 可用于 后续 试验。上 述 DN A提 取 方法为标准推 荐使 用，在保证DN A提 取 质 量能够符 合PC R扩增 需 要的前提下其 它 DN A提 取 方法 均 可采用。5.3 P CR 扩增 5.3.1 S SR 引物 5对基本核 心 引物 名 单见附录B，参照品种RO C2 2和 桂糖11号对 核 心 引物的指纹图谱见附录C。每对引 物的上 游 引物5 端 用 荧光 标 记。5.3.2 反应体系 PC R 反 应 体 系 为20 L，其 中 10 PC R B uf fe r（含 20 mm ol/L Mg 2+）2 L，d N T P（1 0 mm ol/L）0.4 L，上、下 游 引物（10 mo l/L）各 1 L，模板 DN A 4 0 ng，T aq 酶 1 U。5.3.3 反应程序 95 预 变性5 mi n；9 4 变性 3 0 s，5 0 6 5 退火3 0 s（退火温 度详 见附录B），7 2 延 伸 1 mi n，共3 5个 循环；7 2 延伸 5 mi n，4 保 存。5.4 P CR 产物检测 5.4.1 P CR 产物样品准备 将荧光 标 记 的PC R 产 物用 超纯水稀释3 0 倍，从混 合 液中吸取 1 L 加 入到 DN A分 析 仪 专 用 深孔板孔中。板中 每个 孔 分 别 加 入 1 L GS 50 0分 子量 内标和10 L去离子甲 酰胺。将 样品在PC R仪上 95 变性 5 mi n，取 出 立即置 于 冰 上，冷却 10 mi n 以上。离心 10 s后 放到 DN A分析 仪上。5.4.2 开机准备 打开 DNA分析 仪，检 查 仪器 工 作 状 态，更换缓冲 液，灌胶。将装 有样品 的 深孔板放 置 于样品 架 基 座 上，打开 数据 收 集 软件。5.4.3 编板 按照仪器操作程序，创建 电泳 板，输入 电泳 板名称，选择适合的程序和电泳 板 类 型，输入 样品 编 号 或名称。DB 45/T 2 02 6 20 19 3 5.4.4 运行程序 DN A分析仪自 动将毛细管电泳数据、运行参数等存放在仪器中。6 数据采集 6.1 数据表示 6.1.1 应用 Gen eM ark er 等相关软 件对毛细管电泳图谱有效特征数据采集，包括对应 PCR 扩增 产物的电 泳峰的位置、电泳峰的高度、电泳峰的面积。6.1.2 进行毛细管电泳图谱有效特征数据的标准化，分别将每对引物中电泳峰高度最高或者电泳峰面 积最大的电泳峰特征数据标准化为 1，该对引物其余电泳峰则通过其电泳峰高度与最高电泳峰的比值或 者电泳峰面积与最大电泳峰的比值来标准化（参见附录 C）。6.1.3 利用对应 PCR 扩增产物大小的电泳峰的位置及其对应的电泳峰特征数据构建甘蔗 DN A 指纹图谱。通过电泳峰的有无（即 1、0 数据）以 及各个电泳峰特征参数标准化值，可以很清楚地将各品种区分开 来。6.2 结果记录 利用毛细管电泳图谱的电泳峰位置及其对应的电泳峰特征数据参照附录 D 进行汇 总。每份样品的重 复实验中，参照品种 RO C22 和桂 糖 1 1 号的电泳峰的特 征参数标准化值与库中数据一致，并且样品的电 泳峰的特征参数标准化值数据重复性好，该样品数据才可列入 DN A 指 纹数据库。DB 45/T 2 02 6 20 19 4 附 录 A（规范性附录）仪器设备和试剂配制 A.1 仪器设备 A.1.1 PC R扩增仪：规 格 为9 6孔 0.2 mL 反 应 模块。A.1.2 DN A分析仪：能够 分 辨 至 少 1个核苷酸 的差异。A.1.3 高 速冷冻离心机：最 大 离心力 不小于12 50 0 rp m。A.1.4 电 子天 平：精度 为0.01 g。A.1.5 微量 可 调移液 器：规 格 分 别 为10 L、20 L、100 L、2 00 L、1 00 0 L。A.1.6 紫外 分 光光度 计。A.1.7 低温冰箱：-20。A.1.8 制 冰机。A.1.9 水浴锅。A.2 D NA提取溶液的配制(用去离子水和分析纯试剂配制)A.2.1 0.5 mo l/L EDT A溶液 称取 1 86.1 g N a 2 E DT A 2 H 2 O，加 入8 00 mL水，用 固体 N a O H 调 节pH 至 8.0，定 容 至1 00 0 mL，1 0 3.4 k P a（12 1）条件 下 灭菌 20 mi n。A.2.2 1 mo l/L Tr is-HC l溶液 称取6 0.5 5 g T ri s 碱，溶 于 4 00 m L水中，用 H C l调节p H 至 8.0，定 容 至 500 mL，1 0 3.4 k P a（1 2 1）条件 下 灭菌 20 mi n。A.2.3 D NA提取液 称 11.6 9 g N a C l放入烧杯 中，加 入4 0 mL 1 mo l/L 的T ri s-H C l（pH 8.0）和5 0 mL 0.5 mo l/L 的 E DTA（pH 8.0），加 入 25 0 mL 水，再 加 入 12 g S DS，6 5 水浴中 加 热溶解，冷却后 定 容 至 4 00 mL。于 4 保 存。A.2.4 酚:氯仿:异戊醇混合液 将 T r is饱 和 酚、氯仿 和异 戊醇 按25:2 4:1的比 例（V:V:V）配制 混 合 液。A.2.5 70%乙醇 用 量筒量取7 0 m L无水乙醇，用 水 定 容 至10 0 mL。A.2.6 T ri s-ED TA缓冲液 分 别量取 1 mL 1 M 的T ri s-H C l（pH 8.0）和0.2 mL 0.5 M 的 E DT A（pH 8.0），定 容 至10 0 mL，在 1 0 3.4 k P a（12 1）条件 下 灭菌 20 mi n。于 4 保 存。DB 45/T 2 02 6 20 19 5 A.3 P CR扩增溶液的配制(用超纯水配制)A.3.1 dNT P 用水分别配制dA TP、dTTP、d GT P、d CT P 4种脱氧核 糖核苷酸终浓度为10 0 mm ol/L的储存 液。分别量 取4种储存液 20 L 混 合，用12 0 L水 定容，配制成每种核苷酸终浓度为10 mm ol/L的工作 液。在10 3.4 k Pa（12 1）条件 下灭菌20 mi n。于-20 保存。可用购买的满足试验要求的商品试剂。A.3.2 S SR引物 荧光标记引物为HP LC纯 化，无荧光标记引物为P AG E纯化。引 物干粉快速离心，用 水分别配制正向引 物和反向引物至浓度为1 0 mo l/L。DB 45/T 2 02 6 20 19 6 附 录 B（规范性附录）核心引物组合基本信息 核 心 引物组合基本 信息 见 表 B.1。表 B.1 核心引物组合基本信息 引物名称 引物序列 退火温度，等位变异位点 a，bp SCB181 F:GGC GGC TGC TTC TGG GTT TGT R:GGA AGC CGA GGA GCA CGA GGA T 61 115,124,130,150,153,156,159,162,165,168,171,174,177,180 EST2-20 F:ATA AGA TCC GTG GTA GGG TAA R:AGG GAC GAA GGG AGT GC 54 178,180,184,187,190,193 SCB279 F:AGA GGG AGG ACA ACA ACA GG R:CTC CAG TCC CAG CAT AAA GAT 61 143,147,152,153,156,158,161,164 SMC1604SA F:AGG GAA AAG GTA GCC TTG G R:TTC CAA CAG ACT TGG GTG G 58 106,109,112,115,118,121,123,126 SMC336BS F:ATT CTA GTG CCA ATC CAT CTC A R:CAT GCC AAC TTC CAA ACA GAC 62 141,154,161,166,167,169,171,175,177,183 a 等位变异位点 数量不固定，随着甘蔗品种 DNA指纹库的增加，等位变异数可能会增加。DB 45/T 2 02 6 20 19 7 附 录 C（资料性附录）参照品种的核心引物指纹图谱信息 参照品种对核心引物组合的指纹图谱信息见表C.1 C.5。表 C.1 参照品种对核心引物 S CB 181 的指纹图谱信息 品种 特 征参数 ROC22 桂糖11号 等位变异位点，bp 115 124 130 150 165 168 171 174 115 124 150 153 168 171 峰高度（比值）0.12 7 2 1 0.19 0 9 0.37 6 9 0.20 6 4 0.18 0 7 0.16 1 3 0.14 2 6 0.14 7 9 1 0.53 7 8 0.20 0 7 0.38 3 6 0.17 7 9 峰面积（比值）0.22 0 3 1 0.18 4 6 0.37 9 0.19 2 1 0.16 6 1 0.15 1 9 0.13 0 2 0.25 6 1 1 0.71 5 6 0.21 3 7 0.41 6 1 0.18 2 8 DB 45/T 2 02 6 20 19 8 表 C.2 参照品种对核心引物 E ST 2-20 的指纹图谱信息 品种 特征参数 ROC22 桂糖11号 等位变异位点，bp 184 187 190 184 187 190 193 峰高度（比值）0.792 3 1 0.300 1 0.362 3 1 0.276 4 0.144 7 峰面积（比值）0.709 2 1 0.255 9 0.310 7 1 0.244 3 0.137 4 DB 45/T 2 02 6 20 19 9 表 C.3 参照品种对核心引物 S CB 279 的指纹图谱信息 品种 特征参数 ROC22 桂糖11号 等位变异位点，bp 152 156 158 164 156 158 161 164 峰高度（比值）0.537 9 0.486 9 0.467 6 1 0.258 2 0.468 5 0.462 3 1 峰面积（比值）0.541 7 0.476 2 0.450 9 1 0.255 0.458 9 0.464 1 DB 45/T 2 02 6 20 19 10 表 C.4 参照品种对核心引物 S MC 16 04S A 的指纹图谱信息 品种 特征参数 ROC22 桂糖11号 等位变异位点，bp 109 112 118 109 112 115 118 峰高度（比值）0.605 8 0.713 9 1 0.669 5 1 0.337 3 0.339 6 峰面积（比值）0.294 1 0.367 6 1 0.653 1 1 0.336 8 0.318 2 DB 45/T 2 02 6 20 19 11 表 C.5 参照品种对核心引物 S MC 33 6BS 的指纹图谱信息 品种 特征参数 ROC22 桂糖11号 等位变异位点，bp 169 171 177 154 169 峰高度（比值）1 0.593 0 0.828 9 1 0.725 6 峰面积（比值）1 0.598 2 0.812 2 1 0.693 3 DB 45/T 2 02 6 20 19 12 附 录 D（资料性附录）甘蔗品种 D NA 指纹报告书 甘蔗品种DN A 指纹 报告书 见 表 D.1。表 D.1 甘蔗品种 D NA 指纹报告书 材料名称 采样地点和日期 实验重复次数 第 次 引物名称 SCB181 等位变异位点，bp 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）参照品种名称 ROC22 等位变异位点，bp 115 124 130 150 165 168 171 174 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）参照品种名称 桂糖 11 号 等位变异位点，bp 115 124 150 153 168 171 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）引物名称 EST2-20 等位变异位点，bp 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）DB 45/T 2 02 6 20 19 13 表 D.1 甘蔗品种 D NA 指纹报告书(续)（电泳图谱）参照品种名称 ROC22 等位变异位点，bp 184 187 190 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）参照品种名称 桂糖 11 号 等位变异位点，bp 184 187 190 193 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）引物名称 SCB279 等位变异位点，bp 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）参照品种名称 ROC22 等位变异位点，bp 152 156 158 164 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）DB 45/T 2 02 6 20 19 14 表 D.1 甘蔗品种 D NA 指纹报告书（续）（电泳图谱）参照品种名称 桂糖 11 号 等位变异位点，bp 156 158 161 164 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）引物名称 SMC1604SA 等位变异位点，bp 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）参照品种名称 ROC22 等位变异位点，bp 109 112 118 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）参照品种名称 桂糖 11 号 等位变异位点，bp 109 112 115 118 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）DB 45/T 2 02 6 20 19 15 表 D.1 甘蔗品种 D NA 指纹报告书（续）（电泳图谱）引物名称 SMC336BS 等位变异位点，bp 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）参照品种名称 ROC22 等位变异位点，bp 169 171 177 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）参照品种名称 桂糖 11 号 等位变异位点，bp 154 169 峰有无 峰高度（比值）峰面积（比值）（电泳图谱）_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 甘蔗 DNA 指纹图谱采集技术规程 DB45/T 2026 2019 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究