鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求DB37／T 4092—2020.pdf

ICS 07.100 B 50 DB37 山东省地方标准 DB37/T 4092 2020 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求 The general technical requirements of separation and identification of fish intestinal microorganism 2020-08-20 发布 2020-09-20 实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 4092 2020 I 前言本标准按照GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。本标准由山东省海洋局提出并组织实施。本标准由山东省海洋标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：青岛华大基因研究院、青岛市标准化研究院。本标准主要起草人：刘姗姗、乔雪松、王裕宽、王萌萌、杨恒加、王琛、陈建威、苏小珊、翟越、许静、赵丹。DB37/T 4092 2020 1 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求 1 范围本标准规定了鱼类肠道微生物样本的采集、分离、培养、鉴定及保藏等。本标准适用于淡水及海水鱼类肠道微生物的研究。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 30744 深海微生物样品前处理技术规范 SN/T 2632 微生物菌种常规保藏技术规程 3 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 肠道微生物 intestinal microorganism 生长于动物肠道，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物群落。3.2 16S rDNA 是编码16S rRNA 的基因，16S rRNA 为核糖体RNA 的一个亚基，是系统分类研究中最常用的分子标签，可被用于菌种鉴定。3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA/RNA 片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。3.4 Sanger 测序 Sanger sequencing 即双脱氧链终止法测序，为第一代DNA 测序技术，是一种常用的核酸测序技术，用于DNA 分析，由英国生物化学家弗雷德里克桑格于1977 年发明。4 缩略语 DB37/T 4092 2020 2 下列缩略语适用于本文件。PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）OD：光密度（Optical Density）5 基本要求 5.1 实验室通用要求实验室应满足GB 19489 中关于一级或以上级别生物安全实验室的要求。5.2 鱼类样本要求鱼类样本应尽量保证鲜活，死亡鱼类样本最长死亡时间不应超过24 h。5.3 实验用具准备一次性无菌手套、无菌眼科镊、无菌眼科剪、无菌PBS（配方见附录A.1）、2216E 培养基(配方见附录A.2)、LB 培养基（配方见附录A.3）、无菌水、无菌50 mL 离心管、医用托盘、75%消毒酒精、涂布棒等。6 鱼类肠道微生物样本采集和保存 6.1 鱼类肠道微生物样本采集与储存 6.1.1 活体鱼类样本应先进行麻醉，之后，在超净工作台内，用 75%的酒精对鱼体擦拭消毒。6.1.2 将鱼类样品从泄殖腔处沿腹部剖开，用无菌PBS 冲洗鱼类腹部，用吸水纸擦拭腹腔。6.1.3 分离并剪下鱼类完整肠道，将肠道内容物全部挤到无菌离心管中，并将肠道内壁残留物轻刮于离心管中。6.1.4 对肠道内容物进行称重，内容物总质量应控制在 10 g 以下，按1 g 内容物加入3 mL 无菌 PBS 的比例进行稀释，震荡混匀，得到肠道微生物样本。6.2 肠道微生物样本存储肠道微生物样本应储存在2 8 低温环境下，宜立即进行处理，保存期限不应超过一周。7 鱼类肠道可培养微生物的分离、培养及鉴定 7.1 肠道微生物分离和纯化 7.1.1 肠道微生物分离 7.1.1.1 取100 L 肠道微生物样本，用无菌 PBS 稀释到1 000 L，制成10-1样品稀释液，震荡混匀，备用。7.1.1.2 取100 L 10-1样品稀释液，用无菌PBS 稀释到 1 000 L，制成10-2样品稀释液，震荡混匀，备用。7.1.1.3 按上述步骤依次稀释获得10-3、10-4的样品稀释液，震荡混匀，备用。DB37/T 4092 2020 3 7.1.1.4 取10-2，10-3，10-4样品稀释液进行固体培养基平板涂布，涂布平板宜28 恒温培养，培养时间 13 天，每隔12 h 观察菌落生长状态。7.1.2 肠道微生物纯化 7.1.2.1 观察涂布平板的生长情况及菌落形态特征，选择合适稀释度（约 10 200 个菌落）的平板挑选菌落，选择不同形态的单菌落编号后划线，于 28 恒温培养 12 h 24 h。7.1.2.2 观察划线培养菌落形态特征是否单一，对于形态结构不单一的平板继续挑单菌落并划线培养，直至获得菌落形态特征一致的纯培养单菌，并填写菌落形态特征统计表，参见附录 B。7.2 肠道微生物培养挑取分离、纯化出的纯培养单菌落接种至液体培养基中，宜150 rpm 28 条件下恒温震荡培养至菌液OD 600 值达到0.6 1.0 之间。7.3 肠道微生物鉴定 7.3.1 微生物基因组提取对培养得到的菌液进行基因组提取，参照GB/T 30744 内相关内容进行。7.3.2 基因组16S rDNA 基因扩增对所提取菌株基因组的16S rDNA 基因进行PCR 扩增，扩增引物及反应条件详见附录C。7.3.3 PCR 产物电泳检测对扩增所得PCR 产物进行电泳检测，步骤参见附录D。7.3.4 PCR 产物测序及序列比对对检测合格的PCR 产物进行Sanger 测序，测序结果与EzBioCloud 数据库进行序列比对，确定分离微生物的种类并参考附录E 的信息记录表进行记录。7.3.5 其他情况对于测序比对没有结果的菌株，可进行生化鉴定，包括镜检、革兰氏染色、接触酶试验、氧化酶试验等，根据实验结果鉴定菌株种属类别。8 鱼类肠道微生物的保藏 8.1 肠道微生物保藏菌种保藏参见SN/T 2632 规范内容。8.2 保藏微生物信息记录参照附录E 的信息记录表，对保藏信息进行记录。DB37/T 4092 2020 4 A A 附录 A（规范性附录）缓冲液及培养基配方表A.1 给出PBS 配方。表A.1 PBS 配方 NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g 蒸馏水定容至 1 000 mL pH 值 7.4 表A.2 给出2216E 培养基配方。表A.2 2216E 培养基配方蛋白胨 5 g 酵母膏 1 g FePO4 0.01 g 陈海水定容至 1 000 mL 琼脂糖（固体培养基添加）15 g pH 值 7.6 注：适用海水鱼肠道微生物培养表A.3 给出LB 培养基配方。表A.3 LB 培养基配方蛋白胨 10 g 酵母膏 5 g NaCl 10 g 蒸馏水定容至 1 000 mL 琼脂糖（固体培养基添加）15 g pH 值 7.6 注：适用淡水鱼肠道微生物培养 DB37/T 4092 2020 5 B B 附录 B（规范性附录）菌落形态特征统计表表B.1 给出菌落形态特征统计表。表B.1 菌落形态特征统计表菌种编号颜色大小形状质地有无晕圈有无光泽是否湿润是否凸起是否透明培养时间记录人 DB37/T 4092 2020 6 C C 附录 C（规范性附录）菌液PCR 表C.1 给出PCR 反应引物序列。表C.1 PCR 反应引物序列引物名称序列 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R TACGGCTACCTTGTTACGACTT 表C.2 给出PCR 反应体系。表C.2 PCR 反应体系（25 L）组分用量 L 无菌水 17.2 10PCR Buffer 2.5 dNTP 2.0 27F 1.0 1492R 1.0 Taq 酶 0.3 模板（菌液）1.0 表C.3 给出PCR 反应时间。表C.3 PCR 反应时间温度时间循环 94 5 min 1 个循环 94 30 s 30 个循环 55 1 min 72 1 min 72 10 min 1 个循环 4 1 个循环 DB37/T 4092 2020 7 D D 附录 D（规范性附录）电泳测试 D.1 材料准备 Loading buffer，纯化PCR 样品，DL2000 Marker，琼脂糖，TAE 缓冲液，SYBR Safe 染料，凝胶托盘，电泳槽，凝胶用梳子。D.2 电泳检测配制1.5%浓度（w/v）琼脂糖凝胶（小托盘一般需30 mL，中托盘需50 mL，大托盘需100 mL），以4 L/100 mL 的量加入SYBR Safe 染料。吸取Loading buffer、纯化PCR 样品各2 L，混匀。待凝胶冷却后，放入电泳槽。各梳孔内加入3 L 混合样品，加入3 L Marker，接通电源，调节电压至120 V200 V 进行跑凝胶电泳。D.3 凝胶成像将凝胶电泳放入凝胶成像仪成像观察。D.4 产物验证观察电泳条带是否单一、条带是否明亮、产物大小是否为1 500 bp 左右，若满足上述要求，则表明PCR成功。对于没有成功的样品可再次进行PCR 验证，或将保藏的菌液进行活化，培养后再次进行PCR。DB37/T 4092 2020 8 E E 附录 E（规范性附录）菌株信息记录表表E.1 给出菌株信息记录表。表E.1 菌株信息记录表鱼种信息鱼种鱼编号采集日期获取方式采集地点样品状态保藏人备注菌株16S rDNA 鉴定及保藏信息菌株编号 Top-hit taxon Top-hit strain Similarity%保藏时间保藏方式保藏孔位注：鱼种编号和菌株编号可根据自身需要进行编制，如：AK1（1号鮟鱇鱼），2018-AK1-G-001（1 号鮟鱇鱼肠道第一株菌）。DB37/T 4092 2020 9 参考文献 1 中国科学院微生物研究所.菌种保藏手册M.北京：科学出版社，1980.2 张美玲,杜震宇.水生动物肠道微生物研究进展J.华东师范大学学报(自然科学版),2016,2016(1):1-8.3 Roeselers G,Mittge E K,Stephens W Z,et al.Evidence for a core gut microbiota in the zebrafishJ.Isme Journal,2011,5(10):1595.4 Li X,Yu Y,Feng W,et al.Host species as a strong determinant of the intestinal microbiota of fish larvae.J.Journal of Microbiology,2012,50(1):29-37.5 张涵,周涛,王岩.综合养殖池塘中三角帆蚌和鱼类肠道细菌的组成J.水生生物学报,2013(5):824-835.6 邢孟欣,李贵阳,侯战辉,等.不同大菱鲆(Scophthalmus maximus)个体肠道菌群结构差异研究J.现代生物医学进展,2014,14(20):3801-3805.7 王纯,倪加加,颜庆云,等.草鱼与团头鲂肠道菌群结构比较分析J.水生生物学报,2014(5):868-875.8 Sanchez L M,Weng R W,Riener R M,et al.Examining the Fish Microbiome:Vertebrate-Derived Bacteria as an Environmental Niche for the Discovery of Unique Marine Natural ProductsJ.Plos One,2012,7(5):e35398.9 Dong B,Yi Y,Liang L,et al.High Throughput Identification of Antimicrobial Peptides from Fish Gastrointestinal Microbiota.J.Toxins,2017,9(9):266.10 张晓华.海洋微生物学M.中国海洋大学出版社,2007.11 中华人民共和国国务院.医疗废物管理条例J.中华人民共和国国务院公报,2003,3(21):5-10.12 孟庆闻.鱼类学实验指导M.中国农业出版社,1995.13 周德庆.微生物学实验手册M.上海科学技术出版社,1986.14 Robert F.Weaver.分子生物学=Molecular Biology:第3 版:英文M.科学出版社,2008.15 国家微生物资源平台.微生物菌种资源收集整理、保藏技术规程汇编M.北京：中国农业科学技术出版社，2011._