发 布地 方 标 准D B 1 4 3 0 0 7 2 0 2 4I C S 1 1.1 2 0.2 0C C S C 3 0化 妆 品 用 原 料 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 的 鉴 定I d e n t i f i c a t i o n p r o c e s s o f r e c o m b i n a n t h u m a n i z e d c o l l a g e n2 0 2 4-0 5-2 9 发 布 2 0 2 4-0 8-2 8 实 施D B 1 4 3 0 0 7 2 0 2 4I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。本 文 件 由 山 西 锦 波 生 物 医 药 股 份 有 限 公 司 提 出。本 文 件 由 山 西 省 化 妆 品 标 准 化 技 术 委 员 会 归 口。本 文 件 起 草 单 位：山 西 锦 波 生 物 医 药 股 份 有 限 公 司，山 西 省 检 验 检 测 中 心（山 西 省 标 准 计 量 技 术研 究 院）。本 文 件 主 要 起 草 人：王 建、于 玉 凤、卢 彦 宏、孙 丹 丹、何 振 瑞、李 喜 梅、张 朝 敏、张 永 健、刘欣。D B 1 4 3 0 0 7 2 0 2 41化 妆 品 用 原 料 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 的 鉴 定1 范 围本 文 件 适 用 于 化 妆 品 用 原 料 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 的 鉴 定。本 文 件 规 定 了 化 妆 品 用 原 料 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 的 鉴 定 项 目、材 料 和 设 备、鉴 定 方 法、结 果 判 定等。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适用 于 本 文 件。Y Y/T 1 8 8 8-2 0 2 3 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白中 华 人 民 共 和 国 药 典（2 0 2 0 年 版）3 术 语 和 定 义Y Y/T 1 8 8 8-2 0 2 3 界 定 的 以 及 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1肽 段 覆 盖 率（氨 基 酸 序 列 覆 盖 度）P e p t i d e c o v e r a g e肽 段 覆 盖 率（氨 基 酸 序 列 覆 盖 度）是 指 检 测 到 的 肽 段 的 氨 基 酸 数 量 占 该 蛋 白 质 总 氨 基 酸 数 量 的 比例。蛋 白 质 经 过 酶 切 后，采 用 L C-M S 进 行 检 测，鉴 定 到 的 酶 切 后 肽 段 占 理 论 序 列 氨 基 酸 数 量 的 比 例。3.2末 端 氨 基 酸 序 列 T e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e末 端 氨 基 酸 序 列 是 指 蛋 白 质 序 列 中 N 端 和 C 端 的 一 段 序 列。4 原 理选 用 适 宜 的 蛋 白 酶 对 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 进 行 酶 解，酶 解 后 的 肽 段 采 用 高 效 液 相 色 谱-串 联 质 谱 仪检 测 肽 段 覆 盖 率 和 氨 基 酸 序 列。依 据 样 品 氨 基 酸 序 列 与 人 胶 原 蛋 白 某 亚 型 序 列 匹 配 度 判 断 是 否 为 重 组人 源 化 胶 原 蛋 白。5 材 料 和 设 备5.1 试 剂 和 材 料a)水：G B/T 6 6 8 2，一 级；b)碳 酸 氢 铵：纯 度 9 9.5%；D B 1 4 3 0 0 7 2 0 2 42c)盐 酸 胍：纯 度 9 9%；d)二 硫 苏 糖 醇（D T T）：纯 度 9 9%；e)碘 乙 酰 胺（I A M）:纯 度 9 9%；f)甲 酸：质 谱 级；g)乙 腈：质 谱 级；h)超 滤 管；i)胰 蛋 白 酶（T r y p s i n）：测 序 级。注：根 据 不 同 蛋 白 序 列 选 择 适 合 的 酶 进 行 酶 切，可 采 用 多 种 酶 切 综 合 鉴 定，常 用 的 蛋 白 内 切 酶 还 有 赖 氨 酸 蛋 白 酶（L y s-C）、谷氨酰蛋白内切酶（G l u-C）、天冬氨酸蛋白酶（A s p-N）等。5.2 试 剂 配 制5.2.1 碳 酸 氢 铵 溶 液（5 0 m m o l/L）：准 确 称 取 0.3 9 5 g 碳 酸 氢 铵 定 容 于 1 0 0 m L 水 中，混 匀。5.2.2 盐 酸 胍 溶 液（6 m o l/L）：准 确 称 取 2 8.6 6 g 盐 酸 胍 定 容 于 5 0 m L 的 碳 酸 氢 铵 溶 液（5.2.1）中，混 匀（现 用 现 配）。5.2.3 D D T 溶 液（1 m o l/L）：准 确 称 取 0.1 5 4 g 二 硫 苏 糖 醇 溶 于 盐 酸 胍 溶 液（5.2.2）中，混 匀（现 用 现 配）。5.2.4 I A M 溶 液（1 m o l/L）：准 确 称 取 0.1 8 5 g I A M 溶 于 1 m L 盐 酸 胍 溶 液（5.2.2）中，混 匀 后避 光 放 置（现 用 现 配）。5.2.5 T r y p s i n 溶 液（0.2 g/L）：准 确 称 取 2 0 g T r y p s i n，溶 于 1 0 0 L 水 中，混 匀。5.2.6 0.1%甲 酸 水 溶 液：取 1 m L 甲 酸 加 水 定 容 至 1 0 0 0 m L,混 匀。5.2.7 0.1%甲 酸 乙 腈 溶 液：取 5 0 0 L 甲 酸 定 容 于 5 0 0 m L 乙 腈 中，混 匀。5.3 仪 器 设 备5.3.1 高 效 液 相 色 谱-串 联 四 极 杆 飞 行 时 间 质 谱 仪:配 有 电 喷 雾 离 子 源（E S I）。5.3.2 高 速 冷 冻 离 心 机：转 速 不 低 于 1 2 0 0 0 r/m i n。5.3.3 分 析 天 平：感 量 0.0 0 0 1 g。5.3.4 水 浴 锅：温 度 均 匀 度 0.3。5.3.5 涡 旋 振 荡 器。6 鉴 定 方 法6.1 样 品 处 理1)取 1 0 0 L 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 溶 液(1 g/L)置 于 超 滤 管 接 收 管 中，1 2 0 0 0 r/m i n 离 心 1 5 m i n；2)变 性：加 入 1 0 0 L 盐 酸 胍 溶 液（5.2.2）；3)还 原：加 入 2 L D T T 溶 液（5.2.3），涡 旋 震 荡 使 蛋 白 均 匀 分 布 于 溶 液 中，4 2 孵 育 1 h；4)烷 基 化 处 理：超 滤 管 接 收 管 中 加 入 5 L I A M 溶 液（5.2.4），涡 旋 震 荡 使 蛋 白 均 匀 分 布 于 溶 液中，避 光 室 温 放 置 3 0 m i n，1 4 0 0 0 g 离 心 1 5 m i n；5)置 换 溶 液：接 收 管 中 加 入 1 0 0 L 碳 酸 氢 铵 溶 液（5.2.1），1 2 0 0 0 r/m i n 离 心 1 5 m i n，重 复 两 次；6)酶 切：将 接 收 管 取 出 置 于 新 的 超 滤 管 中，再 加 入 碳 酸 氢 铵 溶 液（5.2.1）1 0 0 L，0.2 T r y p s i n溶 液（5.2.5）1 5 L，旋 涡 震 荡，使 蛋 白 溶 液 均 匀 分 布；7)封 口 膜 封 好 放 置 于 3 7 孵 育 1 8 小 时；8)将 超 滤 管 倒 置 离 心，收 集 溶 液。D B 1 4 3 0 0 7 2 0 2 436.2 仪 器 条 件6.2.1 高 效 液 相 色 谱 参 考 条 件a)色 谱 柱：C 1 8，1 5 0*2.1 m m（内 径），粒 度 1.6 m，或 相 当 者；b)流 动 相 A：0.1%甲 酸 水 溶 液（5.2.6）；c)流 动 相 B：0.1%甲 酸 乙 腈 溶 液（5.2.7）；d)流 速：0.2 m L/m i n；e)柱 温：4 0；f)进 样 体 积：4 L；g)流 动 相 梯 度 洗 脱 程 序 见 表 1。表 1 色 谱 分 离 梯 度时间（m i n）A（%）B（%）0 9 8 21 9 8 21 7 7 0 3 02 0 5 5 4 52 1 5 9 52 5 5 9 52 5.1 9 8 23 0 9 8 26.2.2 质 谱 参 考 条 件a)离 子 源：E S I；b)检 测 方 式：正 离 子 模 式；c)M S 扫 描 范 围 2 0 0-2 0 0 0 m/z；d)M S/M S 扫 描 范 围 5 0-2 5 0 0 m/z。6.3 数 据 分 析产 生 的 原 始 数 据 及 图 谱 由 数 据 分 析 软 件 识 别 标 峰 并 导 出 对 应 图 谱，通 过 质 谱 数 据 和 相 关 质 谱 鉴 定图 谱 进 行 数 据 库 匹 配，得 出 肽 段 覆 盖 率 及 末 端 氨 基 酸 序 列 鉴 定 结 果（具 体 示 例 见 附 录 A 中 A.1 及 A.2）。7 结 果 判 定样 品 检 测 出 的 氨 基 酸 序 列 需 与 理 论 氨 基 酸 序 列 一 致，肽 段 覆 盖 率 需 达 到 1 0 0%。将 氨 基 酸 序 列 检 测结 果 和 人 胶 原 蛋 白 某 亚 型 序 列 进 行 比 对，判 断 样 品 是 否 为 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白(具 体 比 对 示 例 见 附 录 A中 A.3）。将 样 品 检 测 出 的 氨 基 酸 序 列 与 人 胶 原 蛋 白 某 亚 型 序 列 进 行 比 对，匹 配 度 1 0 0%，为“A 型 重 组 人 源化 胶 原 蛋 白”；匹 配 度 大 于 等 于 8 0%，小 于 1 0 0%，为“B 型 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白”；匹 配 度 小 于8 0%，则 该 样 品 不 属 于 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白。D B 1 4 3 0 0 7 2 0 2 40附 录 A（资 料 性）一 种 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 质 谱 鉴 定 结 果A.1 肽 段 覆 盖 率 鉴 定 结 果 示 例。图 A.1 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 T r y p s i n 酶 解 产 物 总 离 子 流（T I C）图表 A.1 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 T r y p s i n 酶 解 肽 段 信 息P e p t i d e R T M a s s C a l c.M a s s A d d u c t S t a t e sG P A G E R 2.0 5 8 5.2 8 4 5 8 5.2 8 7 M+2 H:M+HG E R 2.2 3 6 0.1 7 3 3 6 0.1 7 6 M+HG A P G E R 2.2 5 8 5.2 8 4 5 8 5.2 8 7 M+2 H:M+HG A P G F R 6.8 5 6 0 3.3 0 9 6 0 3.3 1 3 M+2 H:M+HG P A G P N G I P G E K 8.4 5 1 0 9 2.5 5 1 0 9 2.5 6 M+3 H:M+2 H:M+HG P A G P N G I P G E K 8.8 1 1 0 9 3.5 4 1 0 9 3.5 4 M+3 H:M+2 H:M+HG P A G P N G I P G E K 9.0 5 1 0 9 3.5 4 1 0 9 3.5 4 M+3 H:M+2 H:M+HD B 1 4 3 0 0 7 2 0 2 41图 A.2 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 L y s-C 酶 解 肽 段 覆 盖 率A.2 末 端 序 列 鉴 定 结 果 示 例。图 A.3 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 L y s-C 酶 解 产 物 C 末 端 肽 段 序 列D B 1 4 3 0 0 7 2 0 2 42图 A.4 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 L y s-C 酶 解 产 物 C 末 端 肽 段 二 级 谱 图图 A.5 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 L y s-C 酶 解 产 物 N 末 端 肽 段 序 列D B 1 4 3 0 0 7 2 0 2 43图 A.6 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 L y s-C 酶 解 产 物 N 末 端 肽 段 二 级 谱 图A.3 氨 基 酸 序 列 与 数 据 库 比 对检 测 得 到 氨 基 酸 序 列 为（G E R G A P G F R G P A G P N G I P G E K G P A G E R G A P）1 6，检 索 N C B I 数 据 库（ht t p s:/b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/B l a s t.c g i），点 击“P r o t e i n B L A S T”，进 入 b l a s t p s u i t e 界 面，在 E n t e r Q u e r yS e q u e n c e 下 框 中 输 入 理 论 氨 基 酸 序 列，点 击 B L A S T，结 果 出 现 后 点 击 H o m o s a p i e n s 对 应 型 别 的 人 胶 原蛋 白。样 品 氨 基 酸 序 列 与 人 胶 原 蛋 白 I I I 型 序 列 片 段 对 比 见 图 A.7。样 品 氨 基 酸 序 列 与 人 胶 原 蛋 白 I I I 型 序列 片 段 一 致，不 含 非 人 胶 原 蛋 白 氨 基 酸 序 列。图 A.7 重 组 人 源 化 胶 原 蛋 白 氨 基 酸 序 列 比 对 结 果