ICS 65.020.30 CCS B 40 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 1238 2024 代替DB15/T 1238-2017 绵羊肺腺 瘤病毒双 抗体夹心ELISA 检测技术 Detection of double antibody sandwich ELISA for jaagsiekte sheep retrovirus(JSRV)2024-05-31 发布 2024-07-01 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 1238 2024 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 代替DB15/T 1238-2017 绵 羊肺 腺瘤 病毒 双抗 体夹心ELISA 检 测技 术，与DB15/T 1238-2017相比，除了 结构 调整 和编 辑性改 动外，主 要技 术变 化如下：a)增加了“规 范性 引用 文件”一章（见 第 2 章）；b)增加了 鼻拭 子样 品采 集和 保存（见 7.2）；c)更改了 包被 抗体（见 附 录A.4，2017 年版A.4）；d)更改TMB 底 物显 色液 和终 止液为 商品 化试 剂，删 除 了原有 的配 制方 法（见5.8、5.9，2017 年版A.8、A.9）。本文件 由内 蒙古 自治 区农 牧厅 提 出。本文件 由内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 19）归口。本文件 起草 单位：内 蒙古 农业大 学。本文件 主要 起草 人：刘淑 英、李 慧萍、张 良、陈思 旭、苗 佳佳、刘 月。本文件 及其 所代 替文 件的 历次版 本发 布情 况为：2017 年首 次发 布为 DB15/T 1238-2017；本次为 第一 次修 订。DB15/T 1238 2024 1 绵羊肺腺 瘤病毒 双抗体夹 心 ELISA 检测技术 1 范围 本文件 规定绵 羊肺 腺瘤病 毒双抗 体夹心ELISA 检测 技 术的试 剂、材 料与 设备、样品前 处理、操作 方法、结 果判 定等。本文件 适 用 于羊 外周 血液 和鼻拭 子样 品中 绵羊 肺腺 瘤病毒 的检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 19489 实验 室 生物 安 全通用 要求 NY/T 541 兽医 诊断 样品 采集、保存 与运 输技 术规 范 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。绵羊肺 腺瘤 病毒 jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV 引起绵 羊肺 腺瘤 的病 原，该病毒 完整 的囊 膜蛋 白具 有致癌 作用，位于 病毒 粒 子的最 外层，是构 成病毒粒子 的主 要结 构蛋 白。衣壳蛋 白 capsid，CA 病毒的 核心 蛋白，蛋 白含 有长约20个 氨基 酸残 基构 成的具 有高 度免 疫原 性的 结构域，且 序列 高度 保守，为 病毒 的特 异抗 原决 定簇。跨膜蛋 白胞 质尾 区 transmembrane protein cytoplasmic tail，CT 病毒囊 膜蛋 白中 跨膜 蛋白 的一个 功 能 区，由44个 氨 基酸 组 成，该 区域 含有 高 度保守 的YXXM 序 列，能特异性 的识 别外 源性JSRV。双抗体 夹 心ELISA 技术 technique of double antibody sandwich ELISA DB15/T 1238 2024 2 特异性 抗体结 合到 固相载 体上形 成固相 抗体，然后 和待检 样品中 的相 应抗原 结合形 成免疫 复合 物，洗 涤 后再 加 酶标 抗 体，与免 疫 复合 物 中抗 原 结合 形成 酶 标抗 体 抗原 固 相抗 体 复合 物 显色 来 检测抗原及其 含量 的技 术。4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。HRP：辣根 过氧 化物 酶（Hydrogen-peroxide Oxidoreductase）OD：吸 光度（Optical Delnsity)PBS：磷酸 盐缓 冲液（Phosphate Buffered Saline）PBST：Tween-20 磷酸 盐缓 冲液洗 涤 液（Phosphate Buffered Saline with Tween-20)pH：酸 碱度（Pondus Hydrogenii）TMB：3,3,5,5-四 甲基 联 苯胺（3,3,5,5-Tetraethylbenzidine）5 试剂 除非另 有说 明，在检 测中 使用的 化学 试剂 均为 分析 纯，实 验室 用水 应符 合 GB/T 6682 中三 级水 的要求。红细胞 裂解 液。配制 按照 附录 A 中A.1。抗体样 品稀 释液。配 制按 照附 录 A 中A.2。包被缓 冲液。配 制按 照附 录 A 中A.3。包被抗 体。配制 按照 附 录A 中A.4。酶标抗 体。配制 按照 附 录A 中A.5。洗涤液。配 制按 照附 录 A 中A.6。封闭液。配 制按 照附 录 A 中A.7。TMB 显 色液。工 作浓 度参 照所购 产品 说明 书。终止液。工 作浓 度参 照所 购产品 说明 书。6 材料与 设备 除非另 有说 明，实验 室应 符合 GB 19489 中生 物安 全 二级实 验室 的要 求。微量加 样器。量 程分 别 0.2 L 2 L、1 L 10 L、10 L100 L、20 L 200 L和100 L 1000 L 的 移液器，并 配备 与移 液器 相匹配 的吸 头。4、-2 0 冰箱。电热恒 温培 养箱。96 孔 酶标 板。酶标检 测仪。旋涡振 荡器。洗板机。计时器。7 样品前 处理 DB15/T 1238 2024 3 动物血 液按 照NY/T 541 中 要求进 行采 集和 保存。取 待检羊 新鲜 抗凝 血 5 mL，3000 r/min 离心15 min，弃 上清，按1:5 的比 例向细 胞沉 淀中 加 入 4 冰箱预 冷的 红细 胞裂 解液 混匀，4 静置 10 min，期间上 下颠 倒混 匀5 次，1000 r/min 离心5 min，离 心弃去 上层 红色 液体，收 集沉淀 部分。如果 沉淀 还有红色，可重 新加 入红 细 胞裂解 液，重 复 1 遍；向 沉淀中 加入 样品 稀释 液 200 L，反复 冻融 或室 温静置1 h 使细 胞破 裂，期间 在旋涡 振荡 器上 振 荡 35 次充分 混合；1000 r/min 离心 5 min，取 上清 液进行检测。鼻拭子 按 照 NY/T 541 中 要求进 行采 集和 保存。将 采集的 羊鼻 拭子 放到 含 有 1 mL 青霉 素-链霉 素PBS 溶 液（2000 IU/mL）的 10 mL 离心 管（EP）中，低温 运送 至实 验室 或者-70 保 存、待 检。将鼻 拭子样品 自然 解冻 之后，通 过涡旋 振荡 器振 荡 3 5 次，在 无菌 环境中，将 EP 管 内液体 转移 到 2 mL EP 管中，4 条 件 下12000 r/min 离心 3 min，吸 取上 清 液进行 检测。8 操作方 法 包被 96 孔酶 标板 每孔 加100 L 包被抗 体（按照 附录A.4），4，过 夜。洗涤 于滤纸 上拍 干96 孔酶 标板 孔内液 体，用PBST洗板5 次，每次3 min。封闭 96 孔酶 标板 每孔 加入 封闭 液200 L，37，孵育60 min。洗涤 于滤纸 上拍 干96 孔酶 标 板 孔内液 体，用PBST洗板5 次，每次3 min。加待检 样品 96 孔酶 标板 每孔 加待 检样 品100 L，37，孵 育60 min。加入 阳性 对照、阴 性对照 和PBS空白对照。注：阳性对照是经 核酸检测 鉴定为 感染JSRV病毒的绵羊肺腺瘤病 肺组织提取蛋 白，浓度 不低于0.016 mg/mL，阴性对照为经核酸检测鉴定为未感染JSRV 病毒的绵羊健康肺组织 提取蛋白。洗涤 于滤纸 上拍 干96 孔酶 标板 孔内液 体，用PBST洗板5 次，每次3 min。加酶标 抗体 96 孔酶 标板 每孔 加稀 释过 的酶标 抗体100 L（按 照 附录A.5），37，孵育60 min。洗涤 于滤纸 上拍 干96 孔酶 标板 孔内液 体，用PBST洗板5 次，每次3 min。显色 96 孔酶 标板 每孔 加TMB显色液100 L，室 温避 光15 min。DB15/T 1238 2024 4 终止 96孔酶 标板 每孔 加终 止液100 L。读值 终止反 应后 将96 孔酶 标板 置于酶 标仪 上，在450 nm 波长下 读取OD值。9 结果判 断 结果分 析条 件设 定 阳 性 对 照 平 均OD 值/阴 性 对 照 平 均OD 值2.1，空 白 对 照 平 均OD 值 阴 性 对 照 平 均OD 值，检 测 结 果 有效，否 则 应 检 查 实 验 操 作 并 重 新 检 测。阳性判 定标 准 被 检 样 品OD 值/阴 性 对 照 平 均OD 值2.1 判 定 为 阳 性。阴性判 定标 准 被 检 样 品OD 值 与 阴 性 对 照 平 均OD值2.1 判 定 为 阴 性。DB15/T 1238 2024 5 A A 附录A（规范 性）试剂配 制 A.1 红细胞 裂解 液 NH4CL 8.29 g，KHCO3 1.00 g，EDTA-Na2 37.2 mg 溶于1000 mL 蒸馏水，NaOH 或 HCL 调 pH 值至 7.4。A.2 抗体样 品稀 释液 NaCL 8.0 g，KH2PO4 0.27 g，Na2HPO4 1.42 g，KCL0.2 g溶于1000 mL 蒸 馏水，NaOH或HCL 调pH 值至7.4。A.3 包被缓 冲液 Na2CO3 1.599 g，NaHCO3 2.939 g，溶解 于800 mL 去离 子水中，NaOH 或HCL 调pH值至9.6，定容 到l L，4 保 存备 用。A.4 包被抗 体 JSRV 衣 壳蛋 白CA 抗 原表 位 富集区 段的蛋 白作 为抗原，按常 规方法 免疫 新西兰 白兔，制备包 被抗 体，浓度为0.018 mg/mL。A.5 酶标抗 体 选取JSRV 囊 膜蛋 白胞 质尾 区抗原 表位 特异 区段 的蛋 白CT作 为抗 原，按常 规方 法免疫 小鼠，制 备单 克隆抗体。用 商品 化HRP 标 记 试剂盒 标记 单克 隆抗 体，制备酶 标抗 体，浓度 为0.012 mg/mL。A.6 洗涤液（PBST）1L pH 值为7.4 PBS 溶 液加 入0.5 mL吐温20（Tween-20）室 温保 存。A.7 封闭液 含5%脱脂 乳的PBST 溶液。