ICS 67.120 CCS X 00 34 安徽省地方标准 DB34/T 8212024 代替DB34/T 821-2008 动物组织 中氯霉素 的残留测 定酶联 免疫吸附法 Determination of chloramphenicol residues in animal animal tissues Enzyme-linked immunosorbent assay 2024-04-15 发布 2024-05-15 实施 安徽省市 场监督 管 理局 发 布.DB34/T 8212024 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替 DB34/T 821-2008动物组织中氯霉素的残留测定酶联免疫吸附法，与 DB34/T 821-2008相比，除结构调整和编辑性修改外，主要技术变化如下：a)适用范围扩大至畜禽肌肉、肝脏、肾脏、尿液及禽蛋、鱼肉、虾肉中氯霉素残留的测定（见第1章，2008版的第 1章）；b)更改了样品处理方法（见 7.1，2008版的 7.1）；c)更改了测定步骤（见第8章，2008版的 7.2）；d)提高了灵敏度，方法检出限降低为：畜禽肌肉、肝脏、肾脏及禽蛋、鱼肉、虾肉中为 0.02 g/kg，动物尿液中为 0.1 g/L（见 10.1，2008版的 9.1）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省兽药饲料监察所提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽省兽药饲料监察所、安徽华澳生物技术有限公司、安徽中青检验检测有限公司、安徽省水产技术推广总站、凤台县畜牧兽医局、宣城市农产品检测中心、霍邱县动物卫生监督所、怀远县畜牧兽医技术推广中心、合肥市农业经济技术服务管理总站。本文件主要起草人：许世富、吴昊、汪秀娟、王伟、颜秀梅、朱玉宜、桂德旺、陈斌、张成立、孙德祥、易文。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：2008年首次发布为 DB34/T 821-2008，2024年第一次修订。DB34/T 8212024 1 动 物组织 中氯霉素 的残留 测定酶 联免疫 吸附法 1 范围 本文件规定了畜禽肌肉、肝脏、肾脏、尿液及禽蛋、鱼肉、虾肉中氯霉素残留量的酶联免疫吸附测定方法。本文件适用于畜禽肌肉、肝脏、肾脏、尿液及禽蛋、鱼肉、虾肉中氯霉素残留量的快速筛选测定。2 规范性 引用 文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和 定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 残留在动物组织、禽蛋或尿液中的氯霉素经乙酸乙酯提取，正己烷脱脂后用于酶联免疫测定。试样中的氯霉素与包被于微孔板中的抗原同特异性抗体进行竞争性免疫反应，加入一定量的显色底物和终止液，在 450 nm 处测定吸光度值，在一定浓度范围内，试样中氯霉素的含量与吸光度大小成反比。换算后可以获得样本中氯霉素的残留量。5 试剂和 溶液 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 的二级水。5.1 氯霉素酶联免疫试剂盒，28 冰箱中保存。5.2 5.2.1 微孔板：包被有氯霉素抗体。5.2.2 氯霉素标准工作液：浓度分别为：0 g/L、0.02 g/L、0.06 g/L、0.18 g/L、0.54 g/L、1.62 g/L。5.2.3 抗体工作液。5.2.4 酶标记物工作液。5.2.5 浓缩样品稀释液。5.2.6 浓缩洗涤液。5.2.7 底物A液。5.2.8 底物B液。5.2.9 终止液。乙酸乙酯。5.3 正己烷。5.4 样品稀释液：取浓缩样品稀释液（5.2.5），用水按 1：9（V/V）稀释，混匀。5.5 DB34/T 8212024 2 洗涤工作液：取浓缩洗涤液（5.2.6），用水按1：19（V/V）稀释，混匀。5.6 底物A、B 混合液：分别取底物 A 液（5.2.7）、底物B 液（5.2.8），按 1：1（V/V）充分混匀，在 5.7 5 min 内使用，避免搅拌，避免使用金属容器盛装。6 仪器设 备 酶标仪：450 nm。6.1 分析天平：感量 0.01g。6.2 匀浆机：10 000 rpm。6.3 离心机：5 000 g。6.4 振荡器。6.5 冰箱。6.6 氮吹仪。6.7 微量加样器及配套吸头：（单道 20 L，50 L，100 L，多道 50 L300 L）。6.8 7 试样制 备 样品处 理 7.1 7.1.1 畜禽 肌 肉、肝脏、肾 脏 及 鱼肉、虾肉 7.1.1.1 畜禽肌肉、肝脏、肾脏，去筋膜；鱼去鳞去骨去内脏，取皮和肌肉部分；虾去头去壳去肠腺。上述样品切成小块，制成糜状，10 000 rpm 均质 2 min。7.1.1.2 取 3 g 0.05 g 均质样品，加入 6 mL 乙酸乙酯（5.3），充分涡动 2 min，室温 4000 g离心 10 min，取 4 mL 上层乙酸乙酯层于新的离心管中，5060 水浴中，氮气吹干；残留物用 2 mL 正己烷（5.4）溶解，充分涡动 10 s，再加入 1 mL 样品稀释液（5.5），低速涡动 1 min，4000 g 以上离心 5 min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质，下层水相备用。7.1.2 禽蛋 7.1.2.1 禽蛋，去壳，将蛋清和蛋黄搅拌均匀。7.1.2.2 取 3 g 0.05 g 均质样品，加入 6 mL 乙酸乙酯（5.3），充分涡动 2 min，室温 4000 g离心 10 min，取 4 mL 上层乙酸乙酯层于新的离心管中，5060 水浴中，氮气吹干；残留物用 2 mL 正己烷（5.4）溶解，充分涡动 10 s，再加入 1 mL 样品稀释液（5.5），低速涡动 1 min，4000 g 以上离心 5 min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质，下层水相备用。7.1.3 尿液 取 0.1 mL 新鲜样品（冷冻或冷藏样品恢复至室温），加入到 0.3 mL 去离子水中，涡动 10 s混匀，备用。样品贮 存 7.2 将试样按照测试样和备用样分别于-20-16 条件下保存。8 测定步 骤 测定在室温（2025）条件下操作，测定之前将试剂盒以及所有试剂恢复至室温（约 1 h2 8.1 h）。按标准工作液和供试样品数量取孔条插入微孔架（5.2），标准工作液和供试样品做两孔平行，记 8.2 录下好对应的位置。DB34/T 8212024 3 分别在各孔中加入 50 L 标准工作液（5.2.2）或7.1 项下待测试样溶液，每孔加入 50 L 抗 8.3 体工作液（5.2.3），用盖板膜封板，轻轻振荡酶标板 10 s，充分混匀，室温下避光反应 30 min。揭开盖板膜，倾出板孔中的液体，在所有微孔中加 260 L 洗涤工作液（5.6），轻轻振荡酶标 8.4 板 15 s30 s，充分混匀，倾出微孔中的洗涤液，在吸水纸上拍干，彻底清除微孔中的残留液和气泡，重复洗板 4 遍。每孔加 100 L 酶标记物工作液（5.2.4），用盖板膜封板，轻轻振荡酶标板 10 s，充分混匀，8.5 室温下避光反应 30 min。重复步骤 8.4，每孔加 100 L 底物 A、B 混合液（5.7），用盖板膜封板，轻轻振荡酶标板 10 8.6 s，充分混匀，室温下避光反应 15 min20 min。揭开盖板膜，每孔加 50 L 终止液（5.2.9），轻轻振荡酶标板 10 s，充分混匀，5 min 内在 8.7 450 nm 下测定吸光度值。9 结果判 定和 表述 用获得的标准工作液和供试样品溶液吸光度值的比值进行计算，见式（1）：9.1 相对吸光度值（%）=%1000BB（1）式中：B标准工作液或供试样品溶液的平均吸光度值；B00浓度的标准工作液的平均吸光度值。将计算的相对吸光度值（%）对应氯霉素标准溶液浓度（g/L）的自然对数作半对数坐标系统曲 9.2 线图，对应的试样浓度（A）可从校正曲线算出。尿液中的氯霉素残留量为 A 乘以稀释倍数 4 即得；动物组织和禽蛋中氯霉素残留量结果计算见式（2）：1000100023 1 V mV V AX（2）式中：X供试样中氯霉素的含量，单位为微克/千克（g/kg）；A供试样的相对吸光度值（%）对应的氯霉素的含量，单位为微克/升（g/L）；V1提取用乙酸乙酯的总体积，单位为毫升(mL)；V2取出吹干的乙酸乙酯体积，单位为毫升(mL)；V3样品稀释液的体积，单位为毫升(mL)；m试样的取样量，单位为克（g）。计算结果表示到小数点后三位。检测结果小于检出限时判为未检出，大于或等于检出限时，应使用色谱质谱联用法进行确认。9.3 10 检测方 法 灵 敏度、准 确度、精密 度 灵敏度 10.1 本方法在畜禽肌肉、肝脏、肾脏及禽蛋、鱼肉、虾肉中的检出限为 0.02 g/kg；在动物尿液中的检出限为 0.1 g/L。准确度 10.2 本方法在 25 倍检出限添加浓度水平上的回收率为 80120。精密度 10.3 DB34/T 8212024 4 本方法的批内变异系数CV 30，批间变异系数CV30。