ICS 65.120 CCS B 20 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 2245.1 2024 饲料中真 菌毒素类 物质的测 定 第1 部分：环匹阿 尼酸的测 定 液相色谱 串联质 谱法 Determination of mycotoxins in feeds Part 1:Determination of cyclopiazonic liquid chromatography tandem mass spectrometry 2024-05-14 发布 2024-07-14 实施 湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB42/T 2245.1 2024 I 目 次 前言.III 引言.V 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理.1 5 试剂与材料.1 6 仪器与设备.2 7 样品.2 8 实验步骤.2 9 精密度.4 附录 A（资料性）环匹阿尼酸多反应离子监测（MRM）色谱图.5 DB42/T 2245.1 2024 III 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是DB42/T 2245饲料中真菌毒素类物质的测定的第1部分，DB42/T 2245已经发布了以下部分：第1部分：环匹阿尼酸的测定液相色谱-串联质谱法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖北省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、湖北省市场监督管理局行政许可技术评审中心、湖北农科质标检测科技有限公司、湖北省农业科学院畜牧兽医研究所。本文件主要起草人：彭茂民、叶芸、张昊、彭西甜、夏虹、易智彬、刘丽、郑丹、严伟、陈芳、胡西洲、周有祥、彭立军。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：；本文件的有关修改意见请反馈至湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，联系电话：027-87389465，邮箱：。DB42/T 2245.1 2024 V 引 言 真菌毒素是由丝状真菌产生的、具有毒性的代谢产物，可使动物出现急性、亚急性和慢性中毒等症状，对人类和动物健康安全产生了较大影响。饲料原料如玉米、花生、小麦、饲草等及其副产品容易发生霉变而受到真菌毒素污染，进而污染配合饲料、浓缩饲料等饲料产品。因此，我国对饲料原料和饲料产品中多种常见真菌毒素如黄曲霉毒素、呕吐毒素等设立了限量标准。随着科学技术的进步和研究的深入，更多的真菌毒素类物质对畜禽养殖业的影响日益受到人们的关注。湖北省是畜禽养殖大省，为建立这类新的真菌毒素类物质在饲料中含量的测定方法，进一步保障湖北省饲料质量安全、推动湖北省畜禽养殖产业高质量发展、保障消费者健康，制定本文件。DB42/T 2245拟由两个部分构成。第1部分：环匹阿尼酸的测定 液相色谱串联质谱法。目的在于规范饲料中环匹阿尼酸含量的测定方法。第2部分：链格孢霉毒素的测定 液相色谱串联质谱法。目的在于规范饲料中链格孢霉毒素含量的测定方法。DB42/T 2245.1 2024 1 饲 料中 真 菌毒素类 物质 的 测定 第 1 部分：环匹阿 尼酸的 测定 液相 色谱-串联 质谱法 1 范围 本文件规定了饲料中环匹阿尼酸含量测定的液相色谱-串联质谱法。本文件适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中环匹阿尼酸含量的测定。注：本文件的方法检出限为0.6g/kg，定量限为2.0g/kg。2 规范性 引用 文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料试样的制备 3 术语和 定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 试样中的环匹阿尼酸经酸化乙腈提取，提取液经分散固相萃取净化，液相色谱-串联质谱法测定，基质匹配标准溶液校正，外标法定量。5 试剂与 材料 5.1 试剂 5.1.1 水（H2O，CAS 号：7732-18-5）：符合 GB/T 6682 中一级水的规定。5.1.2 乙腈（CH3CN，CAS 号：75-05-8）：色谱纯。5.1.3 乙酸（CH3COOH，CAS号：64-19-7）：色谱纯。5.1.4 甲酸（HCOOH，CAS号：64-18-6）：色谱纯。5.1.5 乙酸铵（CH3COONH4，CAS号：631-61-8）：色谱纯。5.1.6 硫酸镁（MgSO4，CAS号：7487-88-9）：分析纯。5.1.7 氯化钠（NaCl,CAS号：7647-14-5）：分析纯。5.2 溶 液配 制 5.1.8 乙腈-乙酸溶液（99.5+0.5，体积比）：准确量取乙腈 995 mL和乙酸5 mL，混匀。5.1.9 乙酸铵-甲酸水溶液（2 mmol/L）：准确称取 0.1542g乙酸铵（5.1.5）至 1 L容量瓶中，加入DB42/T 2245.1 2024 2 5mL甲酸，用水定容至1 L，摇匀。5.3 标 准品 环匹阿尼酸（C20H20N2O3，CAS 号：18172-33-3）标准品，纯度98.0%。5.4 标 准溶 液配 制 5.1.10 标准储备溶液：精确称取环匹阿尼酸标准品适量，用甲醇配成浓度为 200 g/mL的环匹阿尼酸标准储备溶液，-20 保存，有效期为6个月。5.1.11 标准中间溶液：精密量取环匹阿尼酸标准储备溶液（5.4.1）1 mL，置于棕色容量瓶中，用甲醇定容至100 mL，配成浓度为 2g/mL的标准中间溶液，-20 保存，有效期3 个月。5.5 材料 5.1.12 微孔滤膜：有机系，孔径0.22 m。5.1.13 十八烷基硅烷键合硅胶（C18）:40 m60 m。5.1.14 陶瓷均质子：2 cm（长）1 cm（外径）。6 仪器与 设备 6.1液相色谱-三重四级杆质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI）。6.2 分析天平：感量0.1 mg和0.01 g。6.3离心机：转速不低于4200 r/min。6.4涡旋仪。6.5氮吹仪：可控温。7 样品 按GB/T 14699.1的规定采集试样，按GB/T 20195的规定制备试样。取样品至少200 g，粉碎使其全部通过0.425 mm孔径的分析筛，充分混匀，装入密闭容器中，04冷藏保存。8 实验步 骤 8.1 试 验处 理 称取1.00 g（精确至0.01 g）试样置于15 mL离心管中，加入2 mL水涡旋混匀，振荡1 min后，加入4 mL乙腈-乙酸溶液（5.2.1）、1.6 g无水硫酸镁（5.1.6）、0.4 g氯化钠（5.1.7）及1颗陶瓷均质子（5.5.3），盖上盖子剧烈振荡1 min后4200 r/min离心5 min，吸取1 mL上清液到内含150 mg硫酸镁（5.1.6）和50 mg C18（5.5.2）的2 mL离心管中，涡旋振荡混匀1 min。4200 r/min离心5 min，取上清液经0.22 m微孔滤膜（5.5.1）过滤后，待测。8.2 基 质匹 配标 准工 作溶 液配制 使用空白饲料样品前处理后得到的溶液作为稀释溶剂，吸取适量2g/mL的标准中间溶液（5.4.2），配制浓度为2 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、50 g/L、100 g/L和200 g/L的基质匹配标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱测定。8.3 测定 8.3.1 液相 色谱 参考 条件 液相色谱参考条件如下：DB42/T 2245.1 2024 3 色谱柱：C18柱，100 mm 2.1 mm,粒径1.7m；或性能相当者；柱温：40；进样体积：5 L；流动相 A：2 mmol/L乙酸铵+0.5%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；流速：0.3 mL/min。梯度洗脱条件见表 1。表1 流动相 梯度 洗脱 参考 条件 时间，min 流动相 A，%流动相 B，%0 70 30 0.6 70 30 3.0 5 95 5.8 5 95 5.9 70 30 7.4 70 30 8.3.2 质谱 参考 条件 质谱参考条件如下：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描模式；检测方式：多反应离子监测（MRM）；电喷雾电压：5500 V；离子源温度：500；气帘气：0.242 MPa（35 psi）；雾化气：0.276 MPa（40 psi）；辅助加热气：0.276 MPa（40 psi）；碰撞气：0.062 MPa（9 psi）。环匹阿尼酸的质谱测定参考值见表2。表2 环匹阿 尼酸 的质 谱测 定参 考值 名称 定性离子对 m/z 定量离子对，m/z 碰撞能量 eV 去簇电压 V 环匹阿尼酸 337/196 337/196 31 130 337/182 25 130 DB42/T 2245.1 2024 4 8.3.3 定性 测定 在相同试验条件下，试样中待测物质保留时间与标准溶液保留时间偏差在2.5%以内，且试样谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为试样中存在对应的待测物。表3 定性确 证时 相对 离子 丰度 的最大 允许 偏差（%）单位为百分号 相对离子丰度 50 2050（含）1020（含）10 最大允许偏差 20 25 30 50 8.3.4 定量 测定 在上述液相色谱-串联质谱仪器最佳工作条件下，标准工作液与试样交替进样，采用基质匹配标准溶液校正，外标法定量。试样溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，当试样的上机液浓度超过线性范围时，需根据测定浓度，稀释后进行重新测定。8.3.5 实验 数据 的处 理 标准曲线的制备：计算定量离子对（m/z,337/196）的峰面积，以浓度对峰面积作标准曲线，标准曲线方程按式（1）表示：=+.(1)式中：A 标准液中环匹阿尼酸的峰面积；标准液中环匹阿尼酸的浓度（g/L）；得到a和b，则试样溶液中环匹阿尼酸的浓度按式（2）计算：=.(2)式中：试样溶液中环匹阿尼酸的浓度（g/L）；试样溶液中环匹阿尼酸的峰面积；试样中环匹阿尼酸的含量，以质量分数表示，单位为微克每千克（g/kg），按式（3）计算：=c.(3)式中：试样溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）；以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，结果保留 2位有效数字。9 精密度 在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值，不大于该算术平均值的15%。DB42/T 2245.1 2024 5 附录A（资料 性）环匹阿 尼酸 多反 应离 子监 测（MRM）色谱 图 图A.1给出了环匹阿尼酸多反应离子监测（MRM）色谱图。图A.1 环匹阿 尼酸（20 g/L）多反应离 子监 测（MRM）色 谱 图