ICS 65.020 CCS B 39 52 贵州省地方标准 DB52/T 1815 2024 红托竹荪 液体菌种 生产技术 规程 Technical inspection of liquid spawn of Phallus rubrovolvatus 2024-05-15 发布 2024-09-01 实施 贵州省市 场监督 管 理局 发 布 DB52/T 1815 2024 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 生 产技 术条 件.2 5 生 产技 术要 求.2 6 摇 瓶液 体菌 种生 产技 术.3 7 发 酵罐 菌种 生产 技术.4 8 贮藏.6 9 记 录和 存档.6 附录A（资 料性）红托 竹荪液 体菌 种生 产 工 艺流 程.7 附录B（资 料性）红托 竹荪液 体菌 种.8 附录C（资 料性）红托 竹荪干 重测 定方 法.9 附录D（资 料性）红托 竹荪液 体菌 种.10 DB52/T 18152024 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由贵州省农作物品种资源研究所提出。本文件由贵州省农业农村厅归口。本文件起草单位：贵州省农作物品种资源研究所、纳雍县农业农村局、剑河县农业农村局、贵州省果树蔬菜工作站。本文件主要起草人：桂阳、黄万兵、朱国胜、刘宏宇、张军、周韬、卢颖颖、龚光禄、杨通静、杨锌沂、王沁、周剑南、尚念杰、黄晓润、李彪、刘倾城、胡腾文。DB52/T 1815 2024 1 红托竹荪 液体菌 种生产技 术规程 1 范围 本 文件 规定 了红 托竹 荪液 体菌种 生产 术语 和定 义、生 产技术 要求、液体 菌种 生产 工艺与 流程、贮藏、记录和 存档 等。本 文件 适用 于红 托竹 荪液 体菌种 的生 产。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 150.2 压力 容器 第2 部分:材料 GB 5749 生活 饮用 水卫 生 标准 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 50073 洁净 厂房 设计 规范 NY/T 528 食用 菌菌 种生 产技术 规程 NY/T 1742 食 用菌 菌种 通 用技术 要求 NY/T 1846 食 用菌 菌种 检 验规程 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。红托竹 荪 Phallus rubrovolvatus(M.Zang,D.G.Ji&X.X.Liu)Kreisel 红托竹 荪，属 于担 子菌 门、腹 菌纲、鬼笔 目、鬼 笔科、鬼 笔属。多 数群 生或 丛 生，由菌 盖、菌 柄、菌裙和 菌托 组成，可 食用。液体菌 种 liquid spawn 用于生 产和 销售 的菌 丝体 及其生 长基 质组 成的 液体 繁殖材 料，包括 摇瓶 液体 菌种和 发酵 罐菌 种。液体菌 种发 酵罐 cultivation apparatus for liquid spawn 进行液 体菌 种培 养的 专用 设备，符合GB 150.2 要求。液体菌 种接 种器 liquid interface trap inoculator 能将液 体菌 种从 培养 器中 按无菌 操作 要求 转接 到固 体培养 基物 料上 的设 备。固体种 solid spawn 在玻璃 试管/平 皿上 固体 培 养基内 生长 的纯 菌丝 体培 养物。DB52/T 1815 2024 2 4 生产技 术条 件 液体菌 种生 产场 所选 择 4.1.1 液体菌 种生 产场 所要 求 生产场 所符 合NY/T 528 的 环境要 求。且 建在 交通 便利、水 源和 电源 充足，无 有害 气体、烟 雾和 灰沙，远离垃 圾场和畜禽场舍 厂房。发 酵车间 增设摇瓶 菌种培养 室 和发酵罐菌种 培养室，设计符合GB 50073 的要求。4.1.2 液体菌 种生 产车 间要 求 4.1.2.1 液体菌种生产车间地面应防水、防滑、防腐蚀、防渗漏和易清洗，有适当的排水坡度（1.0%1.5%）和 良好 的 排水系 统。墙 壁和 天花板 应防潮、防霉、防 水和易 清洗。入口处 应 设 置洗手、消毒和 干手 设施，用 水符 合GB 5749 的要求。应安 装排气 管道、进 水管 道、蒸汽管 道、热水 循环 管道 和排风设 备，配置 封闭 式废 物桶，用水 符 合 GB/T 6682 的要 求。4.1.2.2 液体菌 种接 种间 应设 置缓 冲间。灭菌 间、冷却 间和 培养间 应符 合 NY/T 528 要 求。生产设 备与 设施 4.2.1 生产设 备 包括液 体菌 种发 酵罐、空 气压缩 机、高效 空气 过滤 器、液 体菌 种接 种器、高 压蒸汽 灭菌 锅、蒸汽 锅炉、净 化工 作台、恒 温摇 床、恒 温培 养箱、除 湿机 和自备 电源（发 电机）等。其中 液体 菌种 发酵 罐、高压灭菌 锅和 蒸汽 锅炉 应符 合GB 150.2要 求；高效空 气过滤 器应 对粒 径0.1 m 0.2 m 粒子 的捕 集 效率在99.999%以 上。4.2.2 基本设 施 液体菌 种生 产车 间应 包含 配料间、灭菌 室、冷却 间、接种间、培养 间、发酵 间、化验室 和菌 种室 等，其规模 要配 套，布局 合理，有调温 设施。化 验室 有相 应 的实验 检测 设备，菌 种室 有 灭菌设 施和 常规 用具。5 生产技 术要求 菌种选 择 选用高 产、优质、抗 逆性 强 和商 品性 好的 红托 竹荪 品种，生产 质量 符合NY/T 1742 的 要求。引种应进行适 应性 出菇 验证。培养原 料 符合NY/T 528 要 求，生物 制剂及 水不 溶天 然物 料应 不小于60 目。生产工 艺流 程 见附录 A。DB52/T 1815 2024 3 6 摇瓶液 体菌 种生 产技 术 培养基 配方 见附录B。分装 摇瓶液 体培 养基 分装 量不 超过摇 瓶容 积的60%。灭菌 在0.120 MPa 0.140 MPa、温度121 时，灭菌 30 min 40 min。冷却 冷却间 使用 前应 进行 清洁 和除尘 处理。将 灭菌 后摇 瓶液体 培养 基放 置在 冷却 间，液 体培 养基 温度 冷却到室 温 到25。接种 在净化 工作 台上 用接 种工 具挑取35 块红 托竹 荪固 体种（3 mm 3 mm 4 mm 4 mm）到摇 瓶液 体 培养基中，贴 标签。培养 6.6.1 培养条 件 使 用 摇 床 培 养 室 的 前 两 日，采 用 药 物 或 者 紫 外 灯 消 毒。应 在 振 频120 r/min 125 r/min，振 幅 6 cm 10 cm，恒 温25 的 摇床上，培 养12 d15 d。6.6.2 培养期 检查 摇瓶液 体菌 种培 养期 间应 定期检 查，看其 是否 符合 表1和表2指标，拣出 不合 格菌种，并 留样。表1 摇瓶液 体菌 种感 官指 标 项 目 指 标 菌液色泽 菌液呈淡黄色，澄清透明。菌液形态 菌液稍粘稠，菌丝球较稠密，并且在2 h 3 h 间均匀悬浮于液 体中，不分层。菌液气味 浓烈的红 托竹荪菌 香味，无酸 味、无臭 味、无异 味。发 酵罐 排气口的 气味正常，无明显改变。DB52/T 1815 2024 4 表2 摇瓶液 体菌 种理 化指 标 项 目 指 标 pH 值 培养液灭菌前初始 pH 值4.3 左右,灭菌后4.2 左右，发酵结束 时为3.03.9 左右。菌丝干重（g/100 ml）1.0 g/100 mL。菌丝形态和杂菌鉴别 有菌丝球和丛状菌丝体，菌 丝 粗壮，显微镜下见锁状联合 结 构；无霉菌、酵母菌和细菌菌体。留存样品无菌检查 平板上红托竹荪菌丝生长，无霉菌、酵母菌和细菌等杂菌生长。7 发酵罐 菌种 生产 技术 空气过 滤器 的检 查与 灭菌 7.1.1 检查 空气过 滤器 滤芯 使用 前应 拆分检 查，无油 污、料污、无破 损，外壳 内外 壁无 污物、光亮 洁净。7.1.2 灭菌 空气过 滤器 应高 压蒸 汽灭 菌，压力0.120 MPa 0.140 MPa、温度121 下，灭菌 时 间40 min 50 min。发酵罐 检查 与清 洁 7.2.1 检查 检查罐 上的 安全 阀和 压力 表，应 工作 正常。7.2.2 清洗 用流水 冲洗 罐体 内、外，无培养 料残 余物。7.2.3 空消 在发酵 罐罐 体压 力0.120 MPa 0.140 MPa 和温 度121 的条 件下，灭 菌30 min 40 min。菌种培 养基 要求 与制 作 7.3.1 原料要 求 同 5.2。7.3.2 培养基 配方 见附录A。7.3.3 投料与 定容 将配制 好的 液体 培养 基原 料充分 溶解，加适 量温 水 搅拌均 匀，倒 入或 用泵 抽 入发酵 罐中，加水 定容至不超 过罐 体总 容积 的80%，加入0.03%消 泡剂。装 料 时保持 进气 管压0.10 MPa 0.15 MPa，通 气鼓 动液体基料，使 料混 匀，至灭 菌料温 上升 到90 时，关 闭进气 管。清理 加料 口，拧紧上 料口 盖。DB52/T 1815 2024 5 7.3.4 实消 投 料 定 容 完 成 后，利 用 外 源 蒸 汽 实 消。在0.120 MPa 0.140 MPa 和 培 养 基 温 度121，灭菌 30 min 40 min（发 酵罐 容 积100 L1000 L）。7.3.5 冷却和 调压 实消灭 菌结 束后 将冷 水通 入发酵 罐夹 层或 者内 置冷 却系统 中，使培 养基 降温 至24 26。当 压力降到0.05 MPa 时，及时 向发酵 罐内 通无 菌空 气，并维持 罐压0.02 MPa 0.04 MPa。接种 火焰接 种法。把 火圈 放在 投料口 的上 方点 燃，打开 进料口 盖，把摇 瓶液 体菌 种迅速 投入 罐中，接 种量为1%3%，迅 速盖 好进 料口盖、拧 紧，移走 火焰 圈。发酵罐 菌种 培养 条件 培养中 控制 进气 阀的 无菌 空气通 风量1 m/h 2.5 m/h，保 持罐 压0.02 MPa 0.04 MPa、罐体 CO2 浓度不 高于1500 ppm，培 养温度 24 25，培 养10 d 12 d。留样及 检测 7.6.1 留样 固体种 应留 样备 查，按照NY/T 528要求 留 样，数量 应 以每个 批号35 支或 皿。每个批 号摇 瓶菌 种取1 mL 装于2 mL的 冻存 管，留存12 支。每个 批号 发酵 罐灭菌 后的 空白 培养 基取 样取1 mL 装于2 mL 的冻 存管，留存12 支；每个 批号 放罐前48 h从 发酵 罐中 取1 mL装于2 mL的 离心 管，留 存12 支；每个 批号发 酵终止后取 样1 mL装于2 mL 的 冻 存管，留存12 支；样品 均 放置 在4 6 下 保存7 d以上。7.6.2 无菌检 测 7.6.2.1 摇 瓶 液 体 菌 种样 品 和 发酵罐 灭 菌 后 的 空白 培 养 基样品 应 在 无 菌 检测 琼 脂 平板上 25恒温培养2 d 5 d，及 时观 察有 无杂菌 生长，按 照 NY/T 1846 操 作。7.6.2.2 培养过 程中 从发 酵罐 中取 出的样 品应 及时 镜检 与无 菌检测，确 定菌 丝生 长状 态。发酵罐 菌种 放罐 指标 7.7.1 菌种感 官指 标 应符合 表3 的要 求。表3 感官指 标 项 目 指 标 菌液色泽 菌丝球从淡黄色转变为白色，菌液呈白色，澄清透明。菌液形态 菌液稍粘稠，菌丝球稠密，均匀悬浮于液体中，并且在2 h 3 h 不分层。菌液气味 浓烈的红托竹荪香味，无酸味、无臭味、无异味。发酵罐排气口的气味正常。7.7.2 菌种理 化指 标 发酵罐 菌种 理化 指标 见表2。DB52/T 1815 2024 6 表4 理化指 标 项 目 指 标 pH值 发酵罐培养时灭菌前pH值4.3 左右,灭菌后4.2 左右。发酵结束 为3.0 3.9 左右。菌丝干重（g/100 ml）1.3 g/100mL。菌丝形态和杂菌鉴别 显微镜下大量菌丝球，菌丝粗壮，有锁状联合结构。无霉菌、酵母菌和细菌菌体。留存样品无菌培养 平板有红托竹荪菌丝生长，无霉菌、酵母菌和细菌等杂菌生长。8 贮藏 液体菌 种应 立即 使用。否 则，应 向发 酵罐 内持 续通 气保持 罐压 0.02 MPa 0.04 MPa，常 温下 可 保 存 1 d。9 记录和 存档 发酵罐 菌种 生产 的每 个环 节都要 有详 实的 生产 记录，并归 档保 存至 少一 个生 产周期。DB52/T 1815 2024 7 A A 附录A（资料 性）红托竹 荪液 体菌 种生 产工 艺流程 见图A.1。图A.1 红托竹 荪液 体菌 种生 产工 艺流程 放罐 摇瓶培养 固体种 配料 分装 灭菌 冷却 配料 分装 灭菌 冷却 检验检测 10 d 12 d 液体菌种检查 摇瓶菌种 12 d 15 d 搅拌 搅拌 发酵 DB52/T 1815 2024 8 B B 附录B（资料 性）红托竹 荪液 体菌 种 B.1 红托竹 荪平 板培 养基 配方 红托竹 荪平 板培 养 基 配方 包括但 不限 于：葡萄糖5 g、果糖25 g、蛋 白胨2.5 g、硫酸 铵2.5 g、竹叶20 g（煮 汁）、VB60.16 g、IAA1.6 mg、琼脂8 g、木屑100 g、马铃 薯50 g 汁液（煮汁）、马 尾松 屑20 g（煮 汁）、玉 米粉10 g、水1000 mL、pH 自然。将马尾 松、竹 叶、马铃 薯（切 片）准 确称取 后用 电 磁炉煮 汁（20 min 30 min），用4 层纱 布过 滤留 汁，倒入锅 中在 电磁 炉中 加热，加入 其它 试剂，煮 沸，装入锥 形瓶 中，于高 压灭 菌锅中121 灭菌30 min，出锅后 于超 净工 作台 中倒 平皿备 用。B.2 红托竹 荪液 体菌 种培 养基 配方 红托竹 荪液 体菌 种培 养基 配方包 括但 不限 于：葡萄糖5 g、果糖25 g、蛋 白 胨5 g、酵母 粉1 g、硫 酸铵2.5 g、磷酸 二氢 钾1 g、木 屑70 g（煮水 过滤）、玉米粉5 g、自 来水1 L，调pH值至4.3 左右。DB52/T 1815 2024 9 C C 附录C（资料 性）红托竹 荪干 重测 定方 法 C.1 红托竹 荪干 重测 定方 法 红托竹 荪液 体发 酵菌 丝体 收集及 干重 测定 方法 包括 但不限 于：用60 目 筛网 或2 层沙 布 过 滤收集 菌丝 球，用蒸 馏水 反复冲 洗干 净，置于60 电热恒 温鼓 风干 燥 箱中烘干 至恒 重，用电 子天 平称量 菌丝 干重。DB52/T 1815 2024 10 D D 附录D（资料 性）红托竹 荪液 体菌 种 D.1 红托竹 荪液 体菌 种 见图D.1 和D.2。图D.1 摇瓶菌 种 图D.2 发酵罐 菌种 DB52/T 1815-2024