I C S 6 5.0 2 0.2 0B 0 5黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 地 方 标 准DB23D B 2 3 0 8/T 1 8 5 2 0 2 3佳 木 斯 水 稻 品 种（系）稻 瘟 病 抗 性 离 体 叶片 鉴 定 技 术 规 范2 0 2 3-1 2-1 1 发 布 2 0 2 4-0 1-1 1 实 施佳 木 斯 市 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 2 3 0 8/T 1 8 5 2 0 2 3前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。请 注 意 本 文 件 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利，本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 农 业 农 村 局 提 出 并 归 口。本 文 件 由 黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 市 场 监 督 管 理 局 批 准 发 布。本 文 件 起 草 单 位：黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 水 稻 研 究 所。本 文 件 主 要 起 草 人：陆 文 静、王 桂 玲、周 通、周 雪 松、韩 笑。本 文 件 2 0 2 3 年 首 次 发 布。D B 2 3 0 8/T 1 8 5 2 0 2 31佳 木 斯 水 稻 品 种（系）稻 瘟 病 抗 性 离 体 叶 片 鉴 定 技 术 规 范1 范 围本 文 件 规 定 了 佳 木 斯 水 稻 品 种（系）稻 瘟 病 抗 性 离 体 叶 片 接 种 鉴 定 中 接 种 体 制 备、抗 性 鉴 定 和 抗 性评 价 等 技 术 要 求。本 文 件 适 用 于 佳 木 斯 常 规 水 稻 品 种（系）稻 瘟 病 抗 性 的 离 体 叶 片 鉴 定 和 评 价。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的，凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B/T 1 5 7 9 0-2 0 0 9 稻 瘟 病 测 报 调 查 规 范G B/T 1 9 5 5 7.7-2 0 0 2 植 物 品 种 特 异 性（可 区 别 性）、一 致 性 和 稳 定 性 测 试 指 南 水 稻3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准。3.1 水 稻 稻 瘟 病指 由 稻 瘟 病 菌 引 起 的 水 稻 病 害。依 据 病 害 发 生 的 时 期 和 部 位，可 分 为 苗 瘟、叶 瘟、穗 颈 瘟、枝 梗 瘟、粒 瘟 等。3.2 抗 病 性植 物 与 病 原 物 在 长 期 进 化 和 相 互 作 用 的 复 杂 过 程 中，逐 渐 形 成 和 表 现 出 各 种 抵 御 有 害 病 原 物 的 特 征和 能 力。3.2 接 种 物人 工 制 备 能 够 侵 染 寄 主 并 引 起 病 害 的 微 生 物 病 原 体。3.3 接 种 体 制 备制 备 人 工 接 种 用 的 稻 瘟 病 菌 单 孢 菌 液。D B 2 3 0 8/T 1 8 5 2 0 2 323.4 人 工 接 种采 取 人 工 方 法 将 病 菌 直 接 或 间 接 接 种 到 寄 主 植 株 组 织 上 使 其 发 病，如：喷 雾 法、涂 抹 法、注 射 法、针 刺 法 等。3.5 抗 性 评 价根 据 采 用 的 技 术 标 准 判 别 寄 主 植 物 对 特 定 病 害 反 应 程 度 和 抵 抗 水 平 的 定 性 描 述。4 病 原 物 的 采 集、分 离 和 保 存采 集 佳 木 斯 水 稻 种 植 地 区 具 有 典 型 病 斑 的 发 病 组 织。剪 取 含 有 单 个 典 型 病 斑 的 水 稻 组 织，7 5%酒精 和 无 菌 水 漂 洗 后 用 灭 菌 滤 纸 吸 干 水 分，用 无 菌 凡 士 林 将 发 病 组 织 悬 挂 无 菌 培 养 皿 中，2 8 光 照 培 养箱 中 黑 暗 培 养 2 4 h。发 病 组 织 产 孢 后 徒 手 轻 轻 拍 打，使 稻 瘟 病 菌 孢 子 落 至 无 菌 水 琼 脂 平 板 上，显 微 镜 下做 好 单 孢 标 记，无 菌 环 境 下 转 移 至 新 的 水 琼 脂 板 上，2 8 光 照 培 养 箱 中 黑 暗 培 养 1 2 h 2 4 h，显 微 镜 下观 察 孢 子 萌 发 情 况 确 认 分 离 出 稻 瘟 菌 单 孢。剔 除 混 杂 多 孢 平 板，将 单 孢 平 板 置 于 2 8 光 照 培 养 箱 中 培养 3 d 5 d 后 可 长 出 稻 瘟 菌 单 孢 菌 落。将 分 离 得 到 的 无 污 染 单 孢 接 种 在 无 菌 的 水 稻 稻 节 上，放 置 2 8 光 照 培 养 箱 中 培 养 1 5 h，待 组 织 上 布 满 菌 丝 后 做 好 标 记 放 入 干 燥 器 中 密 封 保 存。5 水 稻 的 种 植 与 管 理根 据 需 要 称 取 适 量 的 供 试（待 测）水 稻 种 子，按 常 规 方 法 种 植 水 稻 幼 苗，待 水 稻 生 长 至 3 7 叶 龄时 用 于 接 种。6 接 种 体 制 备将 保 存 稻 瘟 病 菌 单 孢 的 稻 节 置 于 无 菌 培 养 基 中 央 部 位，2 8 光 照 培 养 箱 中 黑 暗 培 养 5 d 7 d，培 养基 表 面 即 可 生 成 大 量 分 生 孢 子。在 产 孢 培 养 皿 上 加 入 灭 菌 水，用 玻 璃 棒 将 菌 落 表 面 形 成 的 分 生 孢 子 洗 下，移 液 枪 转 移 菌 液 至 5 m L E P 管 中，充 分 混 匀 后 用 血 球 计 数 板 测 定 孢 子 浓 度，重 复 测 定 3 次，取 平 均 值。接 种 用 的 分 生 孢 子 悬 浮 液 浓 度 调 至 1 05个 孢 子/m L，保 证 接 种 菌 液 量 不 少 于 2 m L，分 生 孢 子 悬 浮 液 需 现配 现 用。7 离 体 叶 片 接 种剪 取 5 c m 充 分 展 开 心 叶 的 中 下 部 叶 段，用 灭 菌 针 在 叶 正 面、垂 直 于 主 叶 脉 处 制 造 3 个 均 匀 分 布 的微 创 伤 点，每 个 点 长 约 2 m m，注 意 不 要 划 穿 叶 片。将 滤 纸 裁 剪 成 直 径 约 8 c m 的 无 菌 圆 片 至 于 无 菌 培 养皿 中，充 分 用 无 菌 水 浸 湿。将 2 根 灭 菌 牙 签 放 置 滤 纸 片 上 搭 放 上 水 稻 叶 片，牙 签 间 距 2 c m 3 c m。接种 前，先 在 划 伤 叶 段 上 均 匀 喷 洒 灭 菌 水。用 移 液 器 在 划 伤 处 点 接 5 L 1 0 L 孢 子 悬 液，每 个 叶 片 3个 接 种 点，3 次 独 立 重 复。接 种 水 稻 叶 段 的 培 养 皿 先 放 置 于 相 对 湿 度 1 0 0%、2 6 下，黑 暗 培 养 2 4 h D B 2 3 0 8/T 1 8 5 2 0 2 333 6 h；再 将 培 养 皿 摆 放 在 2 6、光 照 条 件 下 保 湿 培 养，每 天 喷 水 1 次 2 次，观 察 叶 片 发 病 情 况。根 据发 病 情 况，在 接 种 后 4 d 7 d 拍 照、记 录。8 抗 病 性 评 价8.1 抗 感 性 判 断抗 性 病 斑 仅 局 限 于 叶 片 划 伤 处，呈 褐 色 点 状，病 斑 中 无 分 生 孢 子 形 成，即 为“+”。感 病 病 斑 呈 梭 形，中 央 灰 色 部 分 生 有 菌 丝 和 分 生 孢 子，外 围 可 能 有 褐 色 坏 死，最 外 层 是 淡 黄 色、形 状 不 规 则，边 缘 呈 现 出暗 绿 色 记 为“-”。8.2 抗 谱 计 算计 算 公 式：C=ab 1 0 0a：形 成 抗 病 病 斑 的 菌 株 数，单 位 为 个；b：总 接 种 菌 株 数，单 位 为 个；C：抗 谱，单 位 为 百 分 率（%）。8.3 抗 瘟 性 评 价 标 准水 稻 稻 瘟 病 抗 性 的 评 价 标 准抗 性 评 价 评 价 标 准（C）%抗 病 R e s i s t a n t（R）C 7 0中 抗 M o d e r a t e l y r e s i s t a n t（M R）5 0 C 7 0中 感 M o d e r a t e l y S u s c e p t i b l e（M S）3 0 C 5 0感 病 S u s c e p t i b l e（S）C 3 0