有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法DB12／T 1271-2023.pdf
ICS 65.080 CCS B 10 12 天津市地方标准 DB12/T 1271 2023 有机肥中 活性大肠 杆菌快速 测定 PMA-qPCR法 Rapid detection of live Escherichia coli in organic fertilizer by PMA-qPCR method(点击此处 添加与 国 际标准一 致性程 度 的标识)2023-11-07 发布 2023-12-08 实施 天津 市市 场监督 管 理委员会 发 布 DB12/T 1271 2023 I 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB12/T 1271 2023 1 有 机肥中 活性大肠 杆菌快 速测定 PMA-qPCR 法 1 范围 PMA-qPCR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB/T 19438.1 RT-PCR GB 19489 NY/T 525 3 术语和 定义 3.1 活性大 肠杆 菌 live Escherichia coli 3.2 暗反应 dark reaction 3.3 光反应 light reaction 4 缩略语 PMA propidium monoazide PCR polymerase chain reaction qPCR PCR quantitative real-time PCR SYBR Green I(SYBR green nucleic acid gel stains)ROX:ROX reference dye 5 原理 DB12/T 1271 2023 2 PMA DNA DNA PMA DNA DNA PCR PMA DNA DNA PMA DNA PCR PCR DNA PCR 6 试剂与 引物 试剂 6.1 6.1.1 GB/T 6682 6.1.2 PMA 5g/L 1mg PMA 200L 20%DMSO-20 6.1.3 PMA PMA 20%DMSO 10 6.1.4 0.01 mol/L pH7.2 PBS GB/T 19438.1 A 6.1.5 95%6.1.6 DNA 6.1.7 SYBR Premix Ex Taq TaKaRa Ex Taq HS dNTP Mixture Mg2+Tli RNaseH SYBR Green I qPCR ROX ROX II 6.1.8 qPCR DNA 引物 6.2 uidA qPCR 1 表1 大肠杆 菌uidA 基因qPCR 扩增引 物 UAL1939b 5-ATGGAATTTCGCCGATTTTGC-3 167 bp UAL2105b 5-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3 7 主要仪 器设 备 0 4 0.01g LED 465 nm 475 nm 37 12000g qPCR 8 样品采 集 采样方 法 8.1 NY/T 525 样品缩 分 8.2 500g 样品运 输及 保存 8.3 DB12/T 1271 2023 3 6 0 4 24h 9 检测步 骤 样品制 备 9.1 1mm 10.0g 90mL PBS 200r/min 30min 4 1000 g 10min PMA 处理 9.2 1mL 0.2mLPMA PMA 80g/mL 10min LED 5min 4 12000 g 5min PBS 2 DNA 提取 9.3 A qPCR 反应 9.4 9.4.1 qPCR 20L SYBR Premix Ex Taq 10L Rox II 0.4L 0.4L ddH2O 6.8L DNA 2L 9.4.2 qPCR 1 50 2 min 95 30 s 40 95 5 s 60 34 s 9.4.3 3 标准曲 线 9.5 DNA 1 DNA ddH2O 10 4 6 qPCR Ct 1 Ccopies copies/mL CDNA DNA g/mL L DNA bp NA 6.02 1023 10 检测结 果 阈值（Ct）设定 10.1 Ct Ct DB12/T 1271 2023 4 质控标 准 10.2 10.2.1 Ct 10.2.2 Ct 27.0 检测结 果确 定 10.3 Ct DNA DB12/T 1271 2023 5 A A 附录A（资料 性）DNA 自 动提 取仪 操作 步骤 A.1 试剂盒 A.1 16 30 表A.1 试剂盒 组成 Magnetic Bead 18 mL 1 Lysis Buffer 180 mL 1 A Washing Buffer A 135mL 2 B Washing Buffer B 40 mL 2 Eluting Buffer 64 mL 1 注1：A 135 mL 95%注2：B 230 mL 95%A.2 耗材 96 48 A.3 仪器及 设备 100L 200L 1000L A.4 操作步 骤 A.4.1 试剂添 加 A.4.1.1 1#/7#500L A.4.1.2 2#3#/8#9#750L A A.4.1.3 4#5#/10#11#750L B A.4.1.4 6#/12#50-200L A.4.1.5 2#/8#50L A.4.1.6 1#/7#200L 95%A.4.2 加样 200L 1#/7#A.1 DB12/T 1271 2023 6 图A.1 萃取样 品盘 A.4.3 启动 96 1 A.4.4 关闭 6#/12#1min-80 B DB12/T 1271 2023 7 参考文 献 1 GB/T 20000.1 2014 1 2 GB/T 6682 3 GB 19489 4 GB/T 19438.1 RT-PCR 5 NY525 6 GB/T 18877-2020 7.M.,2011.8 DNA/RNA 9.D.,2019.10.PMA-qPCR D.,2015.11,.PMA-qPCR J.,2016,43(2):493-498.12,.PMA-qPCR VBNC J.,2016,42(1):144-149.13,.PMA-qPCR J.,2018,29(4):362-366.14,.PMA PCR J.,2010,38(9):142-146.
