ICS 11.220 B 41 备案号：35740-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1606 2012 副猪嗜血杆菌病诊断技术规程 Technical specification of diagnosis for Haemophilus parasuis 2012-12-01发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1606 2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：孟日增、石建平、孟庆峰、宋战昀、蔡阳、王振国、王伟利、肖成蕊、王为。DB22/T 1606 2012 1 副猪嗜血杆菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了副猪嗜血杆菌病的综合诊断技术（临床诊断、病原分离鉴定、聚合酶链式反应、间接 血凝试验）。本标准适用于养猪场或 散 养猪副猪嗜血杆菌病 现 场诊断 与实 验 室 诊断。2 规范性引用文件 下列文件对 于本 文件 的应用 是必不可少 的。凡是注 日 期 的 引 用 文件，仅所注 日 期 的 版 本适用于本 文 件。凡是不注 日 期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验 室 用 水 规 格和 试验 方法 GB 16548 病 害动物和 病 害动物产品生物安全处理 规 程 NY/T 541 动物 疫病 实 验 室 检验 采样方法 3 临床诊断 3.1 流行性病学 副猪嗜血杆菌，其 病原 特征参见附录 A，该 菌 只感染 猪，常感染 2周龄 16周龄 的猪，5周龄 8周 龄 的猪 更易感。该 病主要 通过呼吸系统传播，猪 与 猪 之 间的接 触及排泄物亦可传播，主要 传染源 为病猪和带 菌猪。该 病 发 病 率一般在 10%15%，严重时死亡率可达到 50%。3.2 临床症状 急性 病 例表 现 为 发 热、食欲 不 振 和 厌食，严重时可见呼吸 困难、发 绀、不 愿活 动、关节肿胀、跛行、运 动不 协调以 及死亡。病 程 较长 猪 只 的 体温大都正 常，常 表 现 为 食欲 不 振、消瘦、被毛粗乱，其 行 为主 要 表 现 为 跛行、关节肿胀。急性发 病 耐 过 猪 可 以痊愈，但 病 症 严重，猪 耐 过 后往往表 现 慢 性 病 症，主要 是 被毛粗乱、咳嗽、呼吸 困难 和生 长迟滞。有 些 猪由于 发生 脑膜炎而表 现 肌肉震颤、麻痹 和 惊厥，有 些因腹膜粘连而 常引 起 肠梗阻。3.3 病理学变化 剖 检 可见 浆液 性 或 纤维素 性 胸膜炎、腹膜炎、心 包 炎、关节炎 及 脑膜炎，损伤 或 渗 出 可 波 及 关节表面，尤 其是 腕关节 和 跗关节。肺脏 出血、表面 有 纤维素 性 渗 出 物附 着，全 身淋巴结 水 肿、出血。在 显微 镜 下 观察渗 出 物，可见 纤维蛋白，中 性 粒 细胞 和 较 少 量 的 巨噬细胞。病 死 猪 及 病 料 的 处理 应 符 合 GB 16548的规定。4 病原分离与鉴定 4.1 试剂与材料 DB22/T 1606 2012 2 4.1.1 水 为 符 合 GB/T 6682的 灭 菌 二级 水。4.1.2 培养基 巧克力琼脂，鲜 血 琼脂培 养 基，大 豆酪 蛋白 琼脂固 体 培 养 基（TSA），胰 蛋白 胨 大 豆 肉 汤培 养 基（TSB）。4.1.3 标准菌株 副猪嗜血杆菌标准菌 株，由 指 定单位提 供。4.2 仪器 4.2.1 恒 温 培 养 箱：35 1。4.2.2 灭 菌 培 养 皿：直径 90 mm至 100 mm。4.2.3 细 菌 微 量 生 化 鉴定 管。4.2.4 灭 菌 棉拭子。4.3 病料采集 按 NY/T 541规定的 方法，采 集 病 料。病 料 可包括呼吸 道 分 泌 物 或 具 有 病 变 特征 的 肺脏、肝 脏、脾 脏、胸膜、胸腹 腔 渗 出 浆液、心 包 积 液、心血、关节液 和 脑 组织。4.4 病原分离 4.4.1 采 集 样品，首先 在 巧克力琼脂 平 板、TSA固 体 培 养 基、鲜 血 琼脂 平 板上 分 别划线 接 种，37 培 养 48 h 72 h以后 挑取 单 个 菌 落，再进 行 纯培 养并鉴定。4.4.2 细 菌 涂片，革兰氏 染 色 镜 检。如果 为 革兰氏阴 性 小 杆 状 或 多形 性 小 杆菌，再进 行 一 次巧克力琼脂亚克隆培 养，同 时 接 种鲜 血 琼脂 平 板 和 普 通 琼脂 平 板。4.4.3 巧克力琼脂 平 板 生 长 良好，而 鲜 血 琼脂 平 板 和 普 通 琼脂 平 板没 有 菌 落 生 成则菌 株保存待进 一 步 鉴定。4.5 病原鉴定 4.5.1 生长特性试验 挑取 被 检分离 株 和 副猪嗜血杆菌标准 株 菌 落 接 种绵羊鲜 血 琼脂 平 板 和 2%胨琼脂 平 板上，再 以 金黄色 葡萄 球 菌 点 种 或 垂 直划线，置 37 培 养 48 h。观察 葡萄 球 菌菌 落 周 围 菌 落 生 成 情况，如 愈 靠近 金黄色葡萄 球 菌菌 落 愈大，菌 落 呈圆 形、隆 起、闪 光、半透明；离 葡萄 球 菌 愈 远 则菌 落 愈 小，甚 至 不见 菌 落 生 长，且 不 出 现 溶 血 现 象判 为阳 性。4.5.2 生化实验 培 养 物 接 种 于 添加 有 烟酰胺腺嘌呤 二 核苷酸（NAD）的 脲 酶、氧 化 酶、吲哚，接 触 酶、葡萄 糖、麦芽糖、蔗糖、果 糖、核糖、半乳糖、硝酸盐还 原酶 等 细 菌 微 量 生 化 鉴定 管，置 37 培 养 48 h。按 细 菌 微 量 生 化 鉴定 管 说明书判 定。脲 酶试验、氧 化 酶试验、吲哚 试验 均 阴 性，并 且 接 触 酶、葡萄 糖、麦芽糖、蔗糖、果 糖、核糖、半乳糖、硝酸盐还 原试验 均 阳 性 者判 为副猪嗜血杆菌阳 性。4.5.3 动物回归试验 DB22/T 1606 2012 3 对 分离菌 株 接 种 4周龄 6周龄 非免 疫猪，临床 观察 符 合 3.2且 与 病 理 剖 检 变化符 合 3.3，采 集 病 料 分离 培 养 满足 4.5.1与 4.5.2，则 可 判 为 动物 回 归试验阳 性。4.5.4 结果判定 经 生 长 特性 试验、生 化 试验、动物 回 归试验检 测确 定 均 为阳 性 者，可 判 为副猪嗜血杆菌分离阳 性。5 聚合酶链式反应（PCR）5.1 试剂与材料 5.1.1 对照品 副猪嗜血杆菌标准菌 株 DNA提 取 物 为阳 性对 照，水 作 为 阴 性对 照。5.1.2 rTaq酶 5 U/L，保存 于-20，避免 反 复冻融 或 温 度剧烈 变化，随 用 随 取。5.1.3 10倍 PCR缓 冲液 Mg2+浓度 25 mmol/L。5.1.4 dNTP混 合 液（2.5 mmol/L）含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP四 种 脱氧核苷酸。5.1.5 蛋白 酶 K 浓度 为 10 mg/mL。5.2 引物 PCR引物 P1 5-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT 3 和 P2 5-GGC TTC GTC ACC CTC TGT 3。5.3 仪器 5.3.1 PCR扩 增 仪。5.3.2 电泳仪。5.3.3 凝 胶 成 像 分 析 仪。5.3.4 离心 机：转速 可达到 12000 r/min或 以 上。5.3.5 组织 匀 浆 器 或 研磨器。5.3.6 普 通 冰 箱：-20 或 以 下。5.3.7 低 温 冰 箱：-70 或 以 下。5.3.8 微 量 移 液 器：0.1 L 2.5 L、2 L 20 L、20 L 200 L、100 L 1000 L。5.4 PCR样 品采集与 处 理 按 NY/T 541规定的 方法，采 集待 检猪的病 料 置 于-20 保存。取 约 1 g病 料，剪碎 后 匀 浆 器加 5 mL水 研磨 成 糊 状，煮沸 10 min，高速 10000 r/min离心 5 min，取上 清-20 保存 备 用。另外，按 GB 16548规定 处理 待 检猪。取 可 疑 培 养 物 10000 r/min 离心 5 min，弃 上 清，沉淀 以 无 菌 水重 悬，煮沸 10 min，DB22/T 1606 2012 4 高速 10000 r/min离心 5 min，取上 清-20 保存 备 用。分离 纯化 的菌 株 用接 种 环刮 取 2个 菌 落 洗 脱 于 含100 L无 菌 水 的离心 管，煮沸 10 min，高速 10000 r/min离心 5 min，取上 清-20 保存 备 用。5.5 DNA模板的制 备 采 用 商 品 化 DNA提 取 试 剂盒 进 行 DNA模 板 的 制备，按 操 作说明书 进 行。5.6 PCR反应 体系 10 PCR Buffer 2.5 L，Mg2+（25 mM）1.3 L，P1（20 pmol/L）1.0 L，P2（20 pmol/L）1.0 L，dNTPs（2.5 mM）2.0 L，Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.5 L，模 板 2 L 5 L，加 ddH2O至 总 体积 25 L。5.7 PCR反应 条 件 94 5 min，94 30 s，59 30 s，72 45 s，34个 循环，72 10 min。5.8 PCR产 物 琼脂糖凝胶电泳 制备 1%琼脂 糖 凝 胶，内 加 适 量 溴 化 乙锭 或 其 替代 物，取 PCR产物 10 L 20 L分 别 与 适 量 加 样缓冲 液 混 合 后，加 入 到样品 孔，9 V/cm恒 压 下 电泳 15 min 30 min。将 电泳 好 的凝 胶 放 到 紫外投射 仪或凝 胶 成 像 系统 上 观察结 果。5.9 结果判定 阳 性对 照 扩 增 到 821 bp条 带，同 时 阴 性对 照 未 扩 增 到 条 带时，试验成 立，如果 样品亦 扩 增 到 821 bp条 带，则 确 认 为副猪嗜血杆菌 PCR阳 性。6 间接 血 凝 试验（IHA）6.1 试剂 和 材料 6.1.1 标准对照品 副猪嗜血杆菌 纯化灭 活 抗 原、副猪嗜血杆菌标准阳 性 血 清、副猪嗜血杆菌标准 阴 性 血 清。6.1.2 致敏红细胞 为副猪嗜血杆菌 灭 活 抗 原 致敏 的 绵羊 红 细胞。6.1.3 稀释 剂 含 1%健康兔 血 清 pH 7.2 PBS。6.1.4 96孔 V型板 斜 面 角 度 为 110。6.1.5 微 量 移液 器 可 调节 至 25 L。6.1.6 微 量 振荡 器 DB22/T 1606 2012 5 振 动 频 率不 大 于 2000 r/min。6.2 操作 方 法 6.2.1 血 清的处 理 被 检血 清 0.2 mL于 无 菌 小 试 管 中，56 水 浴 30 min灭 活，冷却 后 加 入 0.3 mL 2%戊 二 醛红 细胞 悬 液，摇 匀，置 37 水 浴 3 min，离心 后 吸 出血 清 供 检验用。阳 性 血 清、阴 性 血 清 的 处理 同 被 检血 清。6.2.2 间接 血 凝 试验（IHA）用 微 量 移 液 器 先 向 反应 板 每孔 中 加 25 L稀释剂，再 向第 1孔 加 人 25 L已 处理 好 的 被 检血 清，充 分 混 匀 后，吸 取 25 L加 入 第 2孔，依 次 做倍比 连 续稀释 至 第 6孔（血 清 的 稀释倍数 为 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64），混 匀 后 从第 6孔 取 出 25 L弃去。向每孔 中 加 入 25 L 2%致敏红 细胞，血 清 的 最 终稀释倍数 为 1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。同 时 应 设 阴、阳 性 血 清 对 照 及 致敏红 细胞 空 白 对 照。置 微 型 振 荡 器 上 震 荡 30 s后，室 温 静 置 2 h，观察结 果。6.3 结果判定 6.3.1 成立条 件 致敏红 细胞 对 照 无自 凝 现 象，阳 性对 照血 清抗 体 价 1:32；阴 性对 照血 清抗 体 价 1:16时 表 明 试验成 立。6.3.2 判定标准 本试验的 判 定标准 如 下：a)+:红 细胞 100%凝 集，在 孔底 凝 集 浓 缩 成 团，面 积 较大；b)+:红 细胞 75%凝 集，在 孔底 形 成 较 厚层 凝 集，面 积 较大，卷边 或 呈 锯齿 状；c)+:红 细胞 50%凝 集，其 余 不 凝 集 的 红 细胞 在 孔底 中 央 集 中成 较大 的 圆点；d)+:红 细胞 25%凝 集，不 完 全 沉 于 孔底，周 围 有散在少 量 的凝 集；e)-:红 细胞 呈点 状 沉 于 孔底，周 边 光 滑。6.3.3 判定 被 检血 清效价 大 于 1:32为阳 性；低 于 1:16为 阴 性；在 1:16 1:32之 间为 可 疑。7 综 合判定 下列 任何 情况 之一，均 可 判 为副猪嗜血杆菌病：a)符 合 流 行 病 学资 料，临床 表 现 明 显，剖 检病 变 典 型，且经 病原分离鉴定为阳 性 者，可 确 诊为副 猪嗜血杆菌病；b)未 经免 疫副猪嗜血杆菌疫 苗，PCR或间接血凝试验阳 性可 判 为副猪嗜血杆菌 感染。DB22/T 1606 2012 6 A A 附 录 A（资 料性 附录）病原学特性 A.1 病原菌 副猪嗜血杆菌为 格 兰氏阴 性 菌，非溶 血 性，NAD依 赖 型 细 菌，有 多种 不 同形 态 的 细 菌，无 鞭 毛，无 芽 胞，新 分离的 致 病菌 有 荚 膜。在 巧克力培 养 基 和 金色葡萄 球 菌 共 同培 养 时，会 在 金色葡萄 球 菌菌 苔 附近呈 卫星 生 长，菌 落直径 达 1 2毫米。该 菌 对 外 界抵 抗 力 不 强，干燥 环 境 易死亡，60 可 存 活 5 min20 min，4 可 存 活 7 d 10 d，对 结 晶 紫、杆菌 肽、红 霉 素、林 可 霉 素、土霉 素、卡那霉 素、磺 胺 类等 药 物 敏 感。A.2 血 清型 副猪嗜血杆菌 存 在 1个 15个 血 清型，其 中血 清型 1、5、10、12、13、14 型 毒 力 最 强，患 猪 在 4 d 内归于 死亡 或 处 于 濒 死 状 态；血 清 2、4、15 型 为中 等 毒 力，患 猪 通常不死亡 但 出 现 多 发性 浆膜炎；血 清 3、6、7、8、9、11 型 感染 猪 后 没 有 明 显 的临床 症 状，这 些 菌 株 归 类 为 无 毒 力 菌 株。而 我 国分离 株 主要 是血 清 4、5、12、13 型，多 为 强毒 力 型。_