ICS 71.100.70 Y 42 DB35 福建省地方标准 DB35/T 13382013 化妆品中天然红4含量测试方法 Determination of natural red 4 in cosmetics 2013-08-01发布 2013-11-01实施 福建省质量技术监督局 发布 DB35/T 13382013 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 标准 化工 作导 则 第1部 分：标 准的 结构 和编 写 给出的 规则 编写。本标准 由福 建省 质量 技术 监督局 提出 并归 口。本标准 起草 单位：福 建省 产品质 量检 验研 究院。本标准 主要 起草 人：林钦、游飞 明、戴明、郑 小严、谢勇。DB35/T 13382013 1 化妆品中天然红 4 含量测定方法 1 范围 本标准 规定 了高 效液 相色 谱法、液相 色谱-串联 质谱法 测 试化 妆品 中天 然红4 含 量的方 法。本方法 适用 于化 妆品 中天 然红4 含量 的测 定。本方法 液相 色谱 法天 然红4（以胭 脂虫 红酸 计）的检 出限为0.2 mg/kg；液 相色谱-串联 质谱 法天 然 红4（以 胭脂 虫红 酸计）的检 出 限为0.1 mg/kg。2 规范性引用文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用水规 格 和试 验方 法（GB/T 6682-2008，neq ISO 3696：1987）3 高效液相色谱法 3.1 方法原理 试样采 用盐 酸溶 液在 沸水 浴下提 取，用聚 酰胺 固相 萃取小 柱富 集、净化，氨 水/甲醇 溶液 洗脱 后注 入高效 液相 色谱 仪 紫外 检测器 进行 测定，外 标法 定量。3.2 试剂和材料 除另有 说明 外，所用 试剂 均为分 析纯，水 为符 合GB/T 6682 规 定的 一级 水。3.2.1 甲醇：色谱 纯。3.2.2 乙腈：色谱 纯。3.2.3 甲酸：优级 纯。3.2.4 氨水：优级 纯。3.2.5 盐酸：36%-38%。3.2.6 洗脱液 配制：250 ml 甲醇+250 ml 水+5.0 ml 氨水。3.2.7 稀释液 配制：250 ml 甲醇+250 ml 水+5.0 ml 甲酸。3.2.8 聚酰胺 固相 萃取 小柱 制作：取3 ml 的固 相萃 取用 空柱，下端 放一 筛板，将粒 度为 74 m 150m（100 目200 目）的 聚酰 胺粉 加入 甲醇 成浆 状，湿 法装 填，上筛 板用 玻 璃棒 压实，聚 酰胺填料的 厚 度约为 2 cm。使 用前用 2 ml 酸化 甲醇（500 ml 甲醇+10 ml 甲酸）和 2 ml 水淋 洗活 化。3.2.9 胭脂虫 红酸（CAS 1260-17-9，C22H20O13，纯度 98.5%）。DB35/T 13382013 2 3.2.10 胭脂虫红酸标准溶液 准确称 取20.0 mg胭 脂虫 红 酸标准 品，加 水溶解 定容 到100 ml，准 确移 取适量 混合标 准储备 液，用稀释液 稀释 成0.4 g/ml、0.8 g/ml、1.0 g/ml、2.0 g/ml、5.0 g/ml 系 列标 准溶 液。3.3 仪器和设备 仪器和 设备 如下：a)高效液 相色 谱仪：配 紫外 检测器；b)涡旋混 合器；c)冷冻高 速离 心机：15000 r/min；d)固相萃 取装 置；e)超声波 振荡 器；f)分析天 平：感量 0.0001 g；g)移液枪：100 l1000 l；h)一次性 过滤 头：聚四 氟乙 烯（PTFE），0.2 m。3.4 分析步骤 3.4.1 试样的制备与提取净化 称取均匀 试样 约2.5 g（精 确到0.0001 g）于50 ml 离 心管中，加入2 mol/l HCl 10.0 ml，旋 紧盖子，置 于沸 水浴 中提 取30 min。取 出冷 却至 室温 后加入15.0 ml 甲醇，振摇 混匀，置于 离心 机中，15000 r/min 离心5 min。取5.0 ml 上清液 于10 ml试 管中，加入5 ml 水混 匀。将溶液 移入聚 酰胺小 柱，控制流速1 ml/min 2 ml/min，用5 ml 水淋 洗小 柱，抽干。用2.0 ml 洗 脱液 洗脱 并用5 ml 刻 度试 管收 集，加入300 l甲酸 并 用 水定 容到2.5 ml，混 匀，用一 次性 过滤头（3.3.8）过滤 后，供 测 定。3.4.2 高效液相色谱操作条件 高效液 相色 谱操 作条 件如 下：a)色谱柱：C18 柱，150 mm 4.6 mm（内径），粒径 5 m，或 相当 者；b)柱温：35；c)紫外检 测波 长：276 nm；d)进样量：20 l；e)流动相 及梯 度条 件见 表 1:表1 流动相及梯度表 时间 min 流速 ml/min 0.3%甲酸%乙腈%0 1.0 80 20 2.0 1.0 80 20 2.1 1.0 30 70 3.0 1.0 30 70 3.1 1.0 80 20 8.0 1.0 80 20 注：上述高效液相色谱操作条件为参考条件，可根据不同仪器、色谱柱进行适当调整。DB35/T 13382013 3 3.4.3 定量测定 外标法 定量：以 标准 工作 溶液浓 度为 横坐 标，以峰 面积积 分值 为纵 坐标，绘 制标准 工作 曲线，用 标 准工作 曲线 对试 样中 待测 组分进 行定 量，试样 溶液 的响应 值应 在标 准工 作曲 线线性 范围 内。在上 述 色 谱 条件下，标 准品 色谱 图见 附录A 中图 A.1。3.5 结果计算 试样中 天然 红4（以胭 脂虫红 酸 计）的含 量按 式（1）计算，结果 保留 到小 数点 后两位：cVXkm=.(1)式中：X 试样 中天 然红4（以 胭脂虫 红酸 计）的含 量，单位为（mg/kg）；m 试样 的质 量，单位 为（g）；c 试样 溶液 中胭 脂虫 红 酸的浓 度，单位 为（g/ml）；V 提取 液体 积，单位 为（ml）；k 稀 释因 子。3.6 允许差 在相同 操作 条件 下，两次 平行测 定结 果的 绝对 差值 不大于 其算 术平 均值 的15%。4 液相色谱-串联质谱法 4.1 原理 试样采 用盐 酸溶 液在 沸水 浴下提 取，用聚 酰胺 固相 萃取小 柱富 集、净化，氨 水/甲醇 溶液 洗脱 后注 入超高 效液 相色 谱-串联 四 级杆质 谱仪 进行 测定，外 标法定 量。4.2 试剂和材料 按本标 准3.2 进行 4.3 仪器和设备 仪器和 设备 如下：a)超高效 液相 色谱-串联 四级杆 质 谱联 用仪：配 有电 喷雾（ESI）离 子源；b)涡旋混 合器；c)超声波 振荡 器；d)固相萃 取装 置；e)冷冻高 速离 心机:15000 r/min；f)分析天 平:感量0.0001 g；g)移液枪：100 l1000 l；h)一次性 过滤 头：聚四 氟乙 烯（PTFE），0.2 m。4.4 分析步骤 DB35/T 13382013 4 4.4.1 试样的制备与提取净化 按本标 准3.4.1 进行 4.4.2 高效液相色谱条件 高效液 相色 谱条 件如 下：a)色谱柱：C18 柱，100 mm2.1 mm（内 径），粒径1.7 m，或 相当 者；b)柱温：35；c)进样量：10 l；d)流动相 及梯 度条 件见 表2：表2 流动相及梯度表 时间 min 流速 ml/min 0.3%甲酸%乙腈%0 0.3 80 20 1.5 0.3 80 20 1.6 0.3 40 60 2.0 0.3 40 60 2.1 0.3 80 20 4.0 0.3 80 20 4.4.3 质谱分析条件 质谱分 析条 件如 下：a)电离源：电 喷雾 正离 子模 式；b)毛细管 电压：4.00 KV；c)源温度：120；d)脱溶剂 气温 度：400；e)脱溶剂 气流 量：700 l/h；f)碰撞室 压力：3.1 10-3 mbar g)特征离 子及 其它质 谱参 数见 表 3：表3 特征离子及其它质谱参数 化合物 母离子（M+H）+m/z 子离子 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 天然红 4 493.0 354.8*20 25 373.0 20 15 注1：*定量离子 注2：上述质谱分析条件为参考条件，可根据不同仪器、色谱柱进行调整。4.4.4 定性测定 每种被 测组 分选 择1 个 母离子，2 个 子离 子，在 相同 实验 条 件下，样品 中待 测物质 的 保留 时间 与标 准 DB35/T 13382013 5 溶液中 对应 的组 分保 留时 间偏差 应 在2.5%之 内；且 样品谱 图中 各组 分定 性离 子的相 对丰 度与 浓度 接近的混合 基质 标准 溶液 谱图 中对应 的定 性离 子的 相对 丰度进 行比 较，若偏 差不 超过 表4 规定 的范 围，则可判定为 样品 中存 在对 应的 待测物。表4 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度%50 20 10 10 最大允许偏差%20 25 30 50 4.4.5 定量测定 外标法 定量：以 标准 工作 溶液浓 度为 横坐 标，以峰 面积积 分值 为纵 坐标，绘 制标准 工作 曲线，用 标 准工作 曲线 对试 样中 待测 组分进 行定 量，试样 溶液 的响应 值应 在标 准工 作曲 线线性 范围 内。在上 述 色 谱 条件下，标 准品 色谱 图见 附录A 中图 A.2。4.5 结果计算 试样中 天然 红4（以 胭脂 虫 红酸计）含 量按 式（2）计 算，结 果保 留到 小数 点后 两位：cVXkm=.(2)式中：X 试样 中天 然红4（以 胭脂虫 红酸 计）的含 量，单位为（mg/kg）；m 试样 的质 量，单位 为（g）；c 试 样溶 液中 胭脂 虫红酸 的 浓度，单位 为（g/ml）；V 提取 液体 积，单位 为（ml）；k 稀释 因子。4.6 允许差 在相同 操作 条件 下，两次 平行测 定结 果的 绝对 差值 不大于 其算 术平 均值 的15%。DB35/T 13382013 6 附 录 A（资料性附录）胭脂虫红酸标准品的液相色谱图和液-质色谱图 3.352AU0.000.050.10分钟0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 图A.1 胭脂虫红酸标准品的液相色谱图 图A.2 胭脂虫红酸标准品的总离子流图和选择离子监测图 _ DB35/T 13382013 福建省地方标准 化妆品天然红 4 含量 测试方法 DB35/T 13382013*2013 年 8 月第一版 2013 年 8 月第一次印刷