ICS 67.080 B 04 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 22742015 金针菇中多糖的测定 苯酚-硫酸法 Determination of polysaccharide for needle mushroom-phenol-sulfuric acid method 2015-02-01发布 2015-03-01实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 22742015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学。本标准主要起草人：宋慧、李雨婷、王健、吴雷、郭志欣、金周雨、郭超、杨雪、王岩、张赫。DB22/T 22742015 1 金针菇中多糖的测定 苯酚-硫酸法 1 范围 本标准规定了金针菇中水溶性多糖含量苯酚-硫酸测定方法。本标准适用于金针菇子实体（干品、鲜品）中水溶性多糖含量的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 15674-2009 食用菌中粗脂肪含量的测定 NY/T 1676-2008 食用菌中粗多糖含量的测定 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 水溶性多糖 Water-soluble polysaccharide 一类能够溶解或者溶胀于H2O中形成水溶液或分散体系的多糖。4 原理 试料经热水提取，通过透析膜透析，得到的多糖在浓硫酸作用下，先水解成单糖，并脱水生成糖醛衍生物，与苯酚生成橙黄色物质，在490 nm处有最大吸收，吸光度值与多糖含量呈正比。5 试剂与材料 除非有特殊说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。5.1 硫酸（H2SO4），=1.84 g/mL。5.2 95%乙醇（CH3CH2OH）。5.3 苯酚（C6H6O），重蒸馏，将苯酚置于 80 的水浴中溶解，然后将一定量的苯酚移至蒸馏烧瓶中。放入玻璃珠数粒，于 182 蒸馏，弃去最初 2 min3 min 蒸馏液，收集随后的蒸馏液，待冷却后备用。警告-苯酚蒸汽有腐蚀性和毒性，重蒸馏需在通风橱内进行。5.4 葡萄糖（C6H12O6）标准品(CAS:50-99-7)。5.5 800 g/L 苯酚溶液：量取 80 g 重蒸馏苯酚（5.3）于100 mL 烧杯中，加水溶解，定容至 100 mL，于棕色磨口瓶中，4 冰箱，贮存期为 2 个月。DB22/T 22742015 2 5.6 50 g/L 苯酚溶液：将 5 mL 800 g/L 苯酚溶液（5.5）稀释为总体积 80 mL混合液，现用现配。5.7 葡萄糖标准储备液：称取 0.1000 g葡萄糖于 100 mL 烧杯中，加水溶解，定容至 100 mL，此溶液浓度为 1.0 g/L，于磨口瓶中，置 4 冰箱，贮存期为 15 天。5.8 葡萄糖标准工作液：将 5 mL 葡萄糖标准储备液（5.7）稀释为总体积 50 mL 混合液，现用现配；5.9 透析袋：D 36 mm，截留分子量 60008000 Da。5.10 标准筛：20目，0.9 mm。6 仪器设备 6.1 紫外-可见分光光度计，1 cm 比色杯。6.2 分析天平，感量 0.0001 g。6.3 离心机，转速在 4000 rpm 以上，离心管容量50 mL。6.4 超声波提取器。6.5 干燥箱，RT+10 250。7 试样的制备 应按照GB/T 15674-2009中6.2的要求进行制备。7.1 干样：将试样剪成小块，于 80 干燥箱中烘至发脆后置于干燥器内冷却，立即粉碎。粉碎样品过孔径为 0.9 mm 的筛。未能过筛的部分再次粉碎或经研磨后再过筛，直至全部样品过筛为止，过筛后的样品全部混匀后装入清洁的广口瓶内密封保存，备用。7.2 鲜样：将试样用手撕或刀切成小块，50 鼓风干燥6 h 以上，待样品半干后逐步提高温度至80，烘至发脆后置于干燥器内冷却，立即粉碎。其他操作同 7.1。8 分析步骤 8.1 提取 应按照NY/T 1676-2008中7.2的要求进行提取。称取1.0 g粉碎过0.9 mm孔径筛的试样（7.1或7.2），精确到0.001 g，置于50 mL具塞离心管内。用5 mL水浸润试样，缓慢加入20 mL无水乙醇，充分振摇，使混合均匀，置超声提取器中超声提取30 min。提取结束后，于4000 rpm/min离心10 min，弃去上清液。不溶物用10 mL乙醇溶液洗涤、离心。用30 mL水分次将上述不溶物全部转入具塞锥形瓶中，以无菌透气封口膜封口后，于沸水浴中提取2 h。冷却至室温，过滤，滤液备用。8.2 透析 可以选择静止透析或流水透析方法。透析后，透析袋内溶液即为试料测定液。8.2.1 静止透析：将滤液转移至长约 15 cm透析袋（5.9）中，封口。将透析袋放入装有蒸馏水的 1000 mL 烧杯中。4 透析1 小时后更换透析外液；继续透析 2 小时后更换透析外液；再继续透析 3小时后更换透析外液；再继续透析 3 小时，弃去透析外液，将透析袋内溶液转至 100 mL容量瓶中，加水定容。8.2.2 流水透析：将透析袋放入500 mL烧杯中，置于装有5 L蒸馏水的下口瓶下方，控制流速10 mL/min，流水透析 6 h-7 h。将透析袋内溶液转至 100 mL容量瓶中，加水定容。8.3 标准曲线的绘制 DB22/T 22742015 3 准确吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 的标准葡萄糖工作液（5.8）于25 mL具塞试管中，用水补至1.0 mL，葡萄糖质量分别为0 g、20 g、40 g、60 g、80 g、100 g，向试管中加入1.0 mL苯酚溶液（5.6），迅速摇匀，沿试管壁加入5.0 mL浓硫酸，迅速摇匀后盖塞，静置10 min，30 水浴反应20 min，迅速冷却，转移至1 cm比色皿中，在490 nm处测定吸光度值。以葡萄糖的质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。8.4 测定 准确吸取0.1 mL试料测定液（8.2）于25 mL具塞试管中，按8.3操作，测定吸光度值。同时做空白试验。9 结果计算 从标准曲线上查得测定液相应含量，单位以克每百克（g/100g）表示，按公式（1）计算：9.01010062 21 1=V MV MC.(1)式中：C样品中多糖的含量，%；M1从标准曲线上查得测定液中葡萄糖含量，g；V1试样提取后定容体积，ml；V2具塞色管中加入待测液体积，ml；M2样品称量质量，g；0.9葡萄糖换算成葡聚糖时的校正系数；注：计算结果保留至小数点后两位。10 精密度 在重复性测定条件下获得的两次平行测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%，以大于这两个测定值的算术平均值的10%的情况不超过5%为前提。_