ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3673 2019 牡蛎疱疹 病毒 型检测技术 规范 巢式 PCR法 Ostreid herpesvirus-1 Detection Specification-Nested PCR 2019-08-30 发布 2019-09-30 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 3673 2019 I 目 次.II 1.1 2.1 3.1 3.1.1 3.2.1 4.1 4.1.2 4.2.2 5.3 5.1.3 5.2.3 5.3.3 6.3 6.1 DNA.3 6.2 PCR.3 6.3.4 7.4 7.1.4 7.2.4 A.5 B DNA.7 DB37/T 3673 2019 II 前 言 GB/T 1.1 2009(TC 03)DB37/T 3673 2019 1 牡 蛎疱疹 病毒 型检 测技术 规范 巢式PCR 法 1 范围 Ostreid herpesvirus-1 OsHV-1 PCR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 SC/T 7205.1 3 术语和 缩略 语 3.1 术语和 定义 3.1.1 牡蛎疱 疹病 毒 型 Malacoherpesviridae Ostreavirus DNA 3.2 缩略语 bp base pair dNTPs deoxy-ribonucleoside triphosphate DNA deoxyribonucleic acid EB ethidium bromide EDTA ethylenediaminetetraacetic acid PCR polymerase chain reaction Taq thermus aquaticus TE Tris EDTA EDTA Tris HCl Tris tris hydroxymethyl aminomethane 4 试剂及 仪器 DB37/T 3673 2019 2 4.1 试剂 4.1.1 GB/T 6682 4.1.2 4.1.3 TE A.1 4.1.4 A.2 4.1.5 K A.3 4.1.6 10 mol/L A.4 4.1.7 Tirs pH 7.8 4.1.8 4.1.8/(25:24:1)4.1.9 4.1.9/(24:1)4.1.10 50 TAE A.5 4.1.11 1 TAE A.5 4.1.12 70%A.6 4.1.13 dNTP 2.5 mmol/L dATP dTTP dGTP dCTP 2.5 mmol/L-20 PCR 4.1.14 10 PCR A.7 4.1.15 MgCl2(25 mmol/L)-20 4.1.16 Taq DNA(5 U/L)-20 4.1.17 CF 5-ATTACCCAGATTCCCCTC-3-20 4.1.18 CR 5-CCACAAATGTAAACTGTGAC-3-20 4.1.19 C3 5-GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3-20 4.1.20 C2 5-TTGCGTTCCGTGACTTCT-3-20 4.1.21 PCR-80 4.1.22 PCR-80 4.1.23 PCR 4.1.24 A.8 4.1.25 6 Loading Buffer A.9 4.1.26 DNA 4.1.27 EB 10 mg/mL A.10 4.2 仪器 4.2.1 4.2.2 PCR 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.2.8-20 4.2.9 80 4.2.10 4.2.11 0.5 L 1 000 L DB37/T 3673 2019 3 5 采样 5.1 采样对 象 5.2 采样数 量、方法 和保 存运 输 SC/T 7205.1 5.3 样品的 采集 2 mm 2 mm 3 cm 3 cm 1.5 mL DNA-20 6 检测 6.1 DNA 的 提取 6.1.1 30 mg 50 mg 500 L 37 1 h 6.1.2 2.5 L 20 mg/mL K 100 g/mL 50 3 h 6.1.3 10 min 10 000 r/min 3 min 6.1.4 1.5 mL/(25:24:1)10 min 10 000 r/min 1 min 6.1.5 1.5 mL/(24:1)10 min 10 000 r/min 1 min 6.1.6 1.5 mL 100 L 10 mol/L(-20)-20 2 h 10 000 r/min 10 min 6.1.7 70%2 10 000 r/min 5 min 6.1.8 100 L DNA 6.1.9 DNA 100 L TE-20 6.1.10 DNA 6.2 巢式PCR 操 作步 骤 6.2.1 第一步 反应 体系 及反 应扩 增程序 PCR 1 25 L DNA DNA DNA PCR 94 5 min 94 30 sec 46 30 sec 72 1 min 32 72 10 min 4 表1 25 L 反 应体 系所 加试 剂 PCR 10.0 2.5 DB37/T 3673 2019 4 表1 25 L 反 应体 系所 加试剂 dNTPs 2.5 mM 2.0 CF 0.5 CR 0.5 Taq DNA 0.5 DNA 1.0 18.0 25.0 6.2.2 第二步 反应 体系 及反 应扩 增程序 6.2.1 PCR 100 C3 C2 PCR PCR 94 5 min 94 30 sec 48 30 sec 72 35 sec 32 72 10 min 4 6.3 电泳及 测序 6.3.1 1.5%10 mg/mL EB 0.5 g/mL 6.3.2 5 L PCR 1 L 6 DNA 6.3.3 1 V/cm 5 V/cm DNA 1/2 2/3 6.3.4 PCR 7 结果 7.1 结果判 定 657 bp 657 bp 1 657 bp 657 bp 657 bp B PCR 7.2 结果表 述 DNA DNA DB37/T 3673 2019 5 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂及 配制 方法 A.1 TE 缓冲 液(pH8.0)1 mol/L Tris HCl(pH8.0)10 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)2 mL 1 000 mL 4 A.2 抽提缓 冲液 1 mol/L Tris HCl(pH8.0)1 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20 mL 1 mg/mL RNA 2 mL 10%SDS 5 mL 100 mL A.3 20 mg/mL 蛋白 酶K K 20 mg 1 mL(0.25 mL/)20 A.4 10 mol/L 乙酸 铵 77 g 30 mL 100 mL 0.45 m 4 A.5 50和 1 TAE 缓冲 液 50 242 g Tris 37.2 g Na2EDTA 2H2O 800 ml 57.1 mL 1 L 1 TAE 100 mL 50 TAE 900 mL A.6 70%乙醇 70 mL DB37/T 3673 2019 6 30 mL 100 mL A.7 10 PCR 反 应缓 冲液 10 PCR Tris-HCl 31.52 mg 15 ml 6 ml KCl 74.55 mg MgCl2 2.86 mg 10 ml-20 A.8 琼脂糖 凝胶 1 TAE 1.2%(1/4)60 10 mg/mL(EB)()0.5 g/mL/0.6 cm 0.8 cm 0.3 cm 0.5 cm 0.2 cm/A.9 6Loading Buffer 6 Loading Buffer 25 mg FF 25 mg 15 ml 6 ml 3 ml 10 ml A.10 10 mg/mL 溴化 乙锭(EB)贮 存液(EB)10 mg 1 mL DB37/T 3673 2019 7 B B 附 录 B（资料 性附 录）检测目 的片 段 的DNA 序列 及电泳 图 B.1 扩增目 的片 段的DNA 序列 Attacccagattcccctcgaggtagcttttgtcaagatgaaacaaaatattatgcaacgaggaaattatacgtcaacatacaacatcactgtgaatacaacggagatttgacaaggtgttctataccatacgacctacacaaacctgtttttgaaaacaggtgtgaagagaaaccaaatgtgtgttatcccaatgcactctttaccatgaagatacccaccaatgtggtaaagacggaacaatctttttctaggatatggagctgcggcgctatggatttaacgagtgccaccaaaagttgggataatgattttagaatagatgtgatgtgcggcaagatgaatggcaagatacacaatgagctattacccgaccacaaacctaacgttgtattcgattacggattaagaaaatgggttccacaatctaaaattaaaaacccacatgggggccaaggaatttaaagccccggggaaaaaagtataaataggcgcgatttgtcagtttagaatcatacccacactcaatctcgagtataccacaactgctaaattaacagcatctactactactactgaaaaatgcagcctttcacagaattttgcaccttgaccaaagccatcacatcagccagcaacgactttttcatcaaccagacgaggttaacatgcgacatttgtaaagagctcgtctctttcaattgcaaagataaagtcgtggcatcattggctgcagtcagatctgacatacccatagaagtcacggaacgcaaagacctgaacctcctcgacctgatccagttcttcgaaaagaagatagagtttaccactctcattgacgaattgttcactgcccacaaagaccattgtcagaaaaatggtaagccgtgcaccatgctcagcatcattgccggtagatacaccaatgaactttaccgcgaagagtccatagaggagaatagatcatgggtgctga aggcatacaaattggacctgatcaatcaacagttctttaggaataacaggttatacgacatcctgaaagaggccggtgtagagaatttggagaggatcatgttagaagatgaaattgaatctgtttgcaagaccaaggccaaatctcccgaagaggtgattaccaagatgattccggaacaattgaccaagctattggaactgatgtcgtgcccccagaaacaggtcacagtttacatttgtgg B.2 示例 1 注：-+M DL2000 DNA Marker 1-8 C 图B.1 检测样 本PCR 电 泳图 _