ICS 65.020.01 B 30 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1624 2019 滑子菇菌 种生产技 术规程 Regulation of Strain Manufacture for Pholiota nameko 2019-04-10 发布 2019-07-10 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 1624 2019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 术 语和 定义.1 3 菌 种生 产要 求.2 4 母 种生 产.3 5 原 种、栽培 种生 产.5 6 入库.8 7 留样.8 DB15/T 1624 2019 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 编写。本标准 由内 蒙古 自治 区农 牧业 科 学院 提出。本标准 由内 蒙古 自治 区农 业标准 化技 术委 员会（SAM/TC 20）归 口。本标准 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院、食 用菌内 蒙古 自治 区工 程研 究中心。本标准 主要 起草 人：王 海 燕、孙国 琴、庞杰、于传 宗、潘 永圣、高 天云、宋秀 敏、郭 俊波、李 国银、云利俊、李 亚娇、闫 明霞。DB15/T 1624 2019 1 滑子菇菌 种生产 技术规程 1 范围 本 标准 规定了 制作 滑 子菇（Pholiota nameko）母种、原种 和栽培 种有关 的定 义、制 作技术 流程 要点等。本 标准 适用 于工 厂 化 生产 企业 和 合作 社生 产的 滑子 菇母种、原 种和 栽培 种。2 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 滑子菇 Pholiota nameko 滑子菇（Pholiota nameko）又名 滑菇、光帽鳞 伞，俗称珍 珠菇，是一种 菌盖 粘滑的 木腐 真 菌。滑子菇菌 盖半 球型、呈 浅黄 色或黄 色，菌柄 比盖 色浅 或淡黄 色、有鳞 片，褶淡 黄色，菌盖 与菌 柄有 菌 膜。2.2 菌种 spawn 菌丝体 生长 在适 宜基 质上 具结实 性的 菌丝 培养 物。分为母 种（一级 种）、原 种（二 级种）和 栽 培种（三级 种）三级。2.3 母种 stock culture 经组织 分离、孢 子分 离等 方式获 得到 的具 有结 实性 的菌丝 体纯 培养 物及 其继 代培养 物，以玻 璃试 管或培养 皿为 培养 容器 和使 用单位，也 称为 一级 种、试管种。2.4 原种 pre-culture spawn 由母种 移植、扩 大培 养而 成的菌 丝体 纯培 养物，也 称为二 级种。2.5 栽培种 spawn 由原种 移植、扩大 培养 而 成的菌 丝体 纯培 养物，也 称为三 级种。栽培 种只 能 用于扩 大到 栽培 出菇 袋或直接 出菇，不 可以 再次 扩大繁 殖 菌 种。DB15/T 1624 2019 2 2.6 固体菌 种 solid spawn 以富含 木质 素、纤维 素和 半纤维 素或 淀粉 含量 高的 谷物粒 等天 然 有 机物 为主 要原料，添 加适 量的 有机氮源 和无 机盐 类，具 一 定水分 含量 的培 养基 培养 的纯菌 丝体。是传 统食 用 菌生产 使用 菌种 状态，也 用于菌种 保存。2.7 液体菌 种 liquid spawn 培养基 营养 成份 与母 种相 同、不 加琼 脂的 液体 培养 基，通 过摇 瓶震 荡培 养或 深层发 酵技 术快 速获 得的大量 的纯 双核 菌丝 体，菌丝体 在液体 培 养基 中呈 絮状或 球状。液 体菌 种可 以作为 原种 或栽 培种 直 接 接种在固体 培 养袋 中，不能 进行菌 种保 存。3 菌种生 产要 求 3.1 人员 经过专 业培 训、掌握 滑子 菇 基础 知识 及白 灵菇 菌种 生产技 术规 程要 求的 技术 人员和 检验 人员。3.2 环境 3.2.1 应选择 地势 高，通风 良好，空气 清新，水 源近，排 水通畅，交 通便 利 的 场所。3.2.2 300 m 之内 无酿 造厂、集 贸市场、规 模养 殖的 畜禽 舍、垃 圾和 粪便 堆积 场，无污水、废 气、废渣、烟 尘和 粉尘 等污 染源。3.3 设施 厂房要 求有 各自 隔离 的摊 晒场、原材 料库、配 料分 装库。配套 有 配 料室、搅 拌室、装袋（瓶）室、灭菌室、冷 却室、接 种室、培养 室（通风 好，有纱 窗）、菌种 检测 室及 菌种 冷藏库 等各 环节 的设 施。冷却室、接种 室，培养 室都 要有离 子净 化设 施。3.4 设备 生产需 要粉 碎机、电 子秤、搅拌 机、装袋（瓶）机、高压 灭菌 锅或 常压 灭菌 锅、离 子净 化器、超 净工作台 或接 种箱、恒 温培 养箱、培养 架、摇床、液 体菌种 灌（30 L 250 L）、显微 镜等 设备。3.5 容器 3.5.1 母种生 产容 器 试 管 选用18 mm180 mm 或者20 mm200 mm；培 养 皿选 用 直径7 cm 9 cm 玻璃培 养 皿或 一次 性塑 料培养皿。3.5.2 原种、栽培 种生 产容 器 3.5.2.1 固体菌 种 3.5.2.1.1 原种采 用850 ml 以 下、瓶 口直径 4 cm、耐 126 高 温的透 明瓶 子，或 采用（12 17）cm（2228）cm 的聚 丙烯 塑 料袋。DB15/T 1624 2019 3 3.5.2.1.2 栽培种 采用 同原 种要 求相 同的瓶 子，也可 采用（15 17）cm（33 35）cm 的聚丙 烯塑 料袋。3.5.2.2 液体菌 种 3.5.2.2.1 三角瓶 液体 菌种 容器：采 用 150 ml 500 ml 三角 瓶，带滤 膜的 封口 膜。3.5.2.2.2 液体菌 种罐：采 用专 业厂 家生产 的液 体菌 种罐。3.6 培养原 料 3.6.1 硫酸镁、磷 酸二 氢钾、蛋 白胨、蔗糖、葡 糖糖、石 膏、琼 脂粉 等均 采用 分析 纯。3.6.2 马铃薯、麦 粒、谷粒、玉 米粒、柠条 粉、棉籽 壳、木屑、玉米 芯粉、豆 秸粉 要求无 霉变。4 母种生 产 4.1 生产流 程 见示例 图1。图1 菌种生 产流 程示 例 4.2 培养基 以下培 养基 任选 其一：PDA 改 良培 养基。麦麸 100 g 加 水 600 ml 煮沸 20 min，滤液 定容 至 500 ml；新 鲜无 病去 皮 马铃 薯 200 g切片加 水600 ml 煮沸 15 min，滤 液定容至 500 ml，二者混 合，加入 硫酸 镁 0.5 g、磷酸二氢 钾1 g、葡 萄糖10 g、蔗糖 10 g、琼脂 粉 10 g 15 g，pH 自 然；新鲜无 病去 皮马 铃 薯 200 g 切片 加水1200 ml 煮沸15 min，滤 液定 容至 1000 ml，加 入蛋白胨 1 g、酵 母粉 1 g、硫 酸镁0.5 g、磷酸 二氢 钾 1 g、葡 萄糖 10 g、蔗糖10 g、琼脂粉10 g15 g，pH 自然；麦粒100 g 加水 1200 ml 煮沸 15 min，滤 液定 容至1000 ml，加 入硫 酸镁0.5 g、磷 酸二氢钾 1 g、葡萄 糖 10 g、蔗糖 10 g、蛋 白胨 5 g、琼脂 粉10 g15 g，pH 自 然；新鲜无 病去 皮马 铃 薯 200 g 切片 加水600 ml 煮沸 20 min，滤液 定容 至 500 ml；100 g 小麦粒加水 600 ml 煮沸 15 min，滤 液定 容 至 500 ml，二者混 合，加入 硫酸 镁 0.5 g、磷酸二氢 钾1 g、蔗糖 10 g、琼脂 粉 10 g15 g，pH 自然。PDA 培 养基。新 鲜无 病去 皮马铃 薯 200 g 切片 加水1200 ml 煮沸 20 min，滤液 定容 至 1000 ml，加入硫 酸 镁0.5 g、磷酸 二 氢钾1 g、葡萄 糖 10 g、蔗糖 20 g、琼脂 粉10 g 15 g，pH 自然。4.3 分装和 灭菌 4.3.1 母种培 养基 温度 降 到 90 即可 分装 至不 同容 器。DB15/T 1624 2019 4 4.3.2 试管母 种 4.3.2.1 分装 分装培 养基至 试管1/4 处，用棉塞 或硅胶 塞封 闭试管 口，每5 支试 管为1把，牛 皮纸包 棉塞，橡皮 筋扎紧，棉塞 向上 放置。棉 塞应采 用梳 棉，不能 使用 脱脂棉。4.3.2.2 灭菌 121 124（0.11 MPa 0.14 MPa）保持25 min。4.3.2.3 冷却 灭 菌 完毕 后 自然 降压，降温 至（655）左 右时 取出 试 管，在 空气 清洁 的 室内 摆 斜面，斜面 长度不超过 试管 长度 的2/3，自 然降温 凝固 后成 斜面。4.3.3 培养皿 母种 4.3.3.1 灭菌 培养基 装入300 ml 500 ml 三角瓶 至 刻度 的2/3 处，用带滤 膜的封 口膜封 口后 灭菌。培养皿 用报 纸包好，同时 放入 灭菌 锅灭 菌。在121 124（0.11 MPa 0.14 MPa）保 持25 min。4.3.3.2 分装 灭菌完 毕后自 然降 压，降 温至70 5 时，取 出 三角瓶 和培养 皿放入 无菌 超净工 作台或 接种 箱内，将三 角瓶 内培 养基 摇 匀 后快 速 均 匀倒 入 无 菌培 养皿中，培养 基占 培养 皿 高度的1/3 1/2。迅速 盖 好上盖。自然 降温 凝固 后制 成平板 培养 基。4.4 检测 抽取3%5%的 试管 和培 养皿，在28 下培 养48 h，无微 生物 长出 为灭 菌合 格。4.5 接种 4.5.1 在超净 工作 台或 接种 箱内 接种，接种 前用 紫外 灭菌 灯照 射 30 min 后打 开风 机 20 min，之 后用75%酒 精进 行表 面消 毒。4.5.2 接种的 菌 块3 mm 5 mm，接种在 培养 皿或 试管 的中 部。培 养皿 需用 石腊 封口 膜密封。4.5.3 接菌过 程 严 格执 行无 菌操 作，接 种后 及时 贴好 标签 并做好 记录。4.6 培养 温度控 制在18 26，空气 湿度 在75%以 下，通风 避 光培 养。4.7 母种检 查 母种接 种后 第3 天、第7 天 和菌丝 体长 满培 养基 后分 别逐个 进行 检验，挑出 未 活、污染 和生 长不 良的不合格 培养 物，拿到 准备 室及时 进行 淘汰 处理。DB15/T 1624 2019 5 表1 滑子菇 母种 感官 要求 项目 要求 容器 完整、无损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 培养基灌入量 为试管总容积的1/4，培养皿高 的的1/3 1/2 菌种外观 菌丝生长量 长满斜面或平板 菌丝体特征 菌丝洁白、绒毛状、生长致密、均匀、健壮 菌丝体表面 均匀、舒展、平整 菌丝体分泌物 无 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 斜面背面外观 培养基不干缩，无积水、颜色均匀、无暗斑、无色素 5 原种、栽培 种生 产 5.1 固体菌 种 5.1.1 培养基 5.1.1.1 粮食培 养基。谷 粒、麦粒 或玉米 粒 90%，柠 条粉、棉籽壳、木 屑、玉米 芯粉 或豆秸 粉 9%，石膏1%，水分 含量（502）%，石灰 水调 节 pH 至6 7。5.1.1.2 组合培 养基：a)B.1 锯沫 58%、玉米 芯 21%、麸子 20%、石膏 1%、水 分含 量（602）%、石灰水 调节 pH至67；b)B.2 柠条粉 60%、玉 米芯21%、麸子 18%、石膏 1%、水 分含 量（602）%、石灰水 调 节pH至67；c)B.3 豆秸粉 60%、玉 米芯21%、麸子 18%、石膏 1%、水 分含 量（602）%、石灰水 调 节pH至67；d)B.4 棉籽壳 80%、麸子19%、石膏 1%、水 分含 量（602）%、石灰 水调 节 pH 至 6 7；e)B.5 柠条粉 80%、麸子19%、石膏 1%、水 分含 量（602）%、石灰 水调 节 pH 至 6 7。5.1.2 装袋（瓶）5.1.2.1 培养基 的多 种组 成按 照比 例称量 干料 搅拌 均匀，边 加水边 混拌 均匀，含 水 量602%。5.1.2.2 采用装 袋（瓶）机或 人工 进行装 袋（瓶）培养 料底 部松上 部较 紧实，人 工装 袋（瓶）需 用打孔器从 袋（瓶）口处 打孔 致底部，孔 直 径1 cm 1.5 cm、深度 是袋（瓶）的 高度。5.1.3 灭菌 5.1.3.1 培养基 质装 袋（瓶）后要 求在 3 h 之 内使 菌种 袋表 面温度 达 到100。灭 菌 可分为 高压 灭菌和常压 灭菌。5.1.3.2 常压灭 菌：保 持 100 8 9 h。5.1.3.3 高压灭 菌：组合 培养 基维 持 121 123（0.11 MPa 0.13 MPa）2 h；粮 食培养 基维 持121 123（0.11 MPa 0.13 MPa）2.5 h。DB15/T 1624 2019 6 5.1.4 接种 5.1.4.1 原种、栽培 种在 超净 工作 台或接 种箱 内接种，接种 前 打开 紫外 灯照 射 30 min，接种 时 用75%酒精对 超净 工作 台或 接种 箱进行 表面 擦拭 消毒。5.1.4.2 原种接 种：每个 原种 接 入2 cm3 cm 大 小母 种 12 块。5.1.4.3 栽培种 接种：每 个栽 培种 接入原 种量 不得 少 于 15 g。菌种 都应 从容 器开 口处 接种，不应 打 孔多点接 种。5.1.4.4 要严格 按无 菌操 作接 种，每批接 种应 为单 一品 种，如中途 换品 种时 采 用75%酒精对 超净 工 作台或接 种箱 进行 表面 擦拭 消毒。5.1.5 培养 温度控 制在21 26，空气 湿度 在75%以 下，通风 避 光培 养。5.1.6 检验 接种后 第7天、第10 天和菌 丝体长 满袋（瓶）后，逐 个全面 检验，挑出 未活、污染和 生长不 良及 破损的不 合格 菌种 袋（瓶）。表2 滑子菇 原种 感官 要求 项目 要求 容器 完整、无破损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（5 0 5）mm 菌种外观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 菌丝体白、生长旺健、整齐 培养物表面菌丝体 生长均匀、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无、允许少量无色至棕黄色水珠 杂菌菌落 无 子实体原基 无 表3 滑子菇 栽培 种感 官要 求 项目 要求 容器 完整、无破损 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（5 0 5）mm 菌 种 外 观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 生长均匀、色泽一致、无角变、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无 杂菌菌落 无 子实体原基 允许少量、出现原基种类5%DB15/T 1624 2019 7 5.1.7 贮存 5.1.7.1 原种和 栽培 种 在 0 4 下贮 存，贮存 期不 超 过50 d。5.1.7.2 贮存摆 放在 层架 或者 贮存 在筐内。5.2 液体菌 种生 产 5.2.1 培养基 以下培 养基 任选 其一：PDA 改 良培 养基。A.1 麦麸100 g 加水600 ml 煮沸 20 min，滤液 定容 至500 ml；新 鲜无 病去 皮 马铃 薯 200 g 切片加 水 600 ml 煮沸 15 min，滤液 定容 至 500 ml，二者 混合，加 入硫 酸镁0.5 g、磷酸二氢 钾1 g、葡萄 糖10 g、蔗糖 10 g，pH 自 然；A.2 新 鲜无 病去 皮马 铃 薯200 g 切片 加水1200 ml 煮沸 15 min，滤液 定容 至 1000 ml，加入蛋白 胨 1 g、酵 母粉1 g、硫酸 镁0.5 g、磷酸 二 氢钾1 g、葡 萄糖 10 g、蔗糖 10 g，pH 自 然；A.3 麦粒 100 g 加水 1200 ml 煮沸 15 min，滤液 定容 至1000 ml，加入 硫酸 镁0.5 g、磷酸二氢 钾1 g、葡萄 糖10 g、蔗糖 10 g、蛋白 胨5 g，pH 自然；A.4 新 鲜无 病去 皮马 铃 薯200 g 切片 加水 600 ml 煮沸 20 min，滤液 定容 至 500 ml；100 g小麦粒 加水 600 ml 煮沸 15 min，滤液 定容 至 500 ml，二者 混合，加 入硫 酸 镁0.5 g、磷酸二氢 钾1 g、蔗糖10 g，pH 自然。PDA 培 养基。新 鲜无 病去 皮马铃 薯 200 g 切片 加水1200 ml 煮沸 20 min，滤液 定容 至 1000 ml，加入硫 酸 镁0.5 g、磷酸 二氢 钾1 g、葡 萄糖10 g、蔗糖 20 g，pH 自然。5.2.2 三角瓶 液体 菌种 生产 5.2.2.1 装瓶 采用150 ml 500 ml 三角 瓶，培 养基 添加 至 刻 度的2/3 处，用带 滤膜 的封 口膜 封口后 灭菌。5.2.2.2 灭菌 121 122(0.11 MPa 0.12 MPa)保持25 min 灭 菌。5.2.2.3 接种和 培养 取3 mm 5 mm 大 小母 种10 块12块 放进 液体 培养 基 中，培养 温度 在16 26，振 荡频 率（搅拌速度）140 r/min 160 r/min 下 振荡 培养8 d10 d。5.2.2.4 检验 液体菌 种接 种后 第3 天对 三 角瓶 逐 个进 行纯度 检 验，及时清 理未 活或 污染 的 三 角瓶，高压 消毒。5.2.3 菌种罐 液体 菌种 生产 5.2.3.1 装罐和 灭菌 填装培 养基至 液体 菌种罐2/3 处，按照液 体菌 种罐说 明书要 求，对 液 体 菌种罐 和液体 培养基 灭菌，待液体 培养 基冷 却至30 以下时 进行 接种。DB15/T 1624 2019 8 5.2.3.2 接种与 培养 5.2.3.2.1 将培养 好的 三角 瓶液 体菌 种接入 到液 体菌 种罐 中，接种量 为培 养基 总体 积 的8%10%，培养温 度（232），搅 拌转 速 150 r/min 160 r/min，灌压 0.04 MPa，通 风量0.7 N m3/h。培 养时间 3 d 5 d。5.2.3.2.2 液体菌 种转 接不 得超 过 3 次。5.2.4 检验 液体菌 种接种 后第3 天对罐 内培养 基 进行 纯度 检验，及时清 理未活 或污 染的罐 内培养 基后，对液 体菌种罐 高压 消毒。表4 滑子菇 液体 菌种 种感 官要 求 项目 要求 容器 完整、无破损、无裂纹 菌丝生长量 培养基 1/2 1/3 菌丝体特征 白色至透明块状、生长旺健 培养基 清澈、无杂色 杂菌 无杂菌 6 入库 6.1 检验合 格的 固体 菌种 应及 时入菌 种库，详 细记 录各 生产环 节，液体 菌种 生产 应该随 用随 生产，不能进行 入库 保存。6.2 菌种库 温度 应 该1 4，避 光，适当 通风 但应 该对空 气进 行杀 菌处 理。母种在 库中 贮存 时间不应长 于 50 d，贮 存时 间 超出 50 d 的母 种应 该进 行 出菇检 验后 再进 行后 续生 产。6.3 每隔 20 d 进行 一次 检查，提出破 损、污染、生 产异 常的菌 种。7 留样 各级菌 种均应 应留 样，每 批次留 样3个（支），贮存 在1 4，贮 存至购 买者购 买后正 常生 产条件下 出第 一潮 菇。_