ICS 65.020 B 40 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 2954 2019 畜禽饲料 中脱氧雪 腐镰刀菌 烯醇的测 定 高效液相 色谱法 2019-03-25 发布 2019-04-25 实施 河 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB13/T 2954 2019 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由衡 水市 质量 技术 监督局 提出。本标准 起草 单位：河 北美 创检测 科技 有限 公司、衡 水市食 品药 品检 验检 测中 心、衡 水市 农业 农 村局。本标准 主要 起草 人：耿春 辉、崔 婧、梁勃、段 培姿、王晖、王 哲、王权、路 明、高 晶、刘志 祥、陈宁。DB13/T 2954 2019 1 畜 禽饲料 中脱氧雪 腐镰刀 菌烯醇的 测定 高效液相 色谱法 警告 使用 本标 准的 人员 应有正 规实 验室 工作 的实 践经验。本标 准并 未指 出所 有可能 的安 全问 题。使用者 有责 任采 取适 当的 安全和 健康 措施，并 保证 符合国 家有 关法 规规 定的 条件。1 范围 本标准 规定 了畜 禽饲 料中 脱氧雪 腐镰 刀菌 烯醇 高效 液相色 谱测 定方 法的 原理、试剂、仪器 和设 备、检测步 骤、结果 计算、准 确度和 精密 度。本标准 适用 于饲 料原 料、配合饲 料中 脱氧 雪腐 镰刀 菌烯醇 的测 定。本标准 的方 法检 出限 为10 g/kg，定 量限 为20 g/kg。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 注日 期的版 本适 用于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动 物饲 料 试样的 制备 3 原理 试样中 的脱 氧雪 腐镰 刀菌 烯醇用 水和 乙腈 的混 合溶 液提取,经 层析 柱净 化,浓 缩、定 容和 过滤 后 用高效液 相色 谱-紫外 检测 器 测定,外标 法定 量。4 试剂 除另有 规定 外，所有 试剂 均为分 析纯，水 为GB/T 6682 规定 的一 级水。4.1 甲醇(CH3OH，CAS 号：67-56-1)，色谱 纯。4.2 乙腈(CH3CN，CAS 号：75-05-8)，色谱 纯。4.3 正己烷(C6H14，CAS 号：110-54-3)，色 谱纯。4.4 活性炭，120 400 目。4.5 酸性氧 化铝，40 80 目。4.6 层析柱,内径 10 mm，长 度150 mm，砂芯 有活 塞。4.7 脱氧雪 腐镰 刀菌 烯醇 标准 品(C15H20O6，CAS 号：51481-10-8)，纯度 99%。DB13/T 2954 2019 2 4.8 脱氧雪 腐镰 刀菌 烯醇 标准 储备液（1.0 mg/mL），准 确称取 脱氧 雪腐 镰刀 菌烯 醇标准 品(4.7)10.0 mg 于 50 mL 烧杯 中，用乙 腈溶解，转 移 到 10 mL 棕 色容量 瓶中，用 乙腈 定容。避光 放置 于4 冰箱中，有效期 为6 个月。4.9 脱氧雪 腐镰 刀菌 烯醇 标准 中间液（100 g/mL），准确吸 取 10.0 mL 脱 氧雪 腐镰刀 菌烯 醇标 准 储备溶液(4.8)于100 mL 容 量瓶中，用 乙腈 定容。避 光放置 于4 冰 箱中，有 效期 为 1 个 月。4.10 脱氧雪 腐镰 刀菌 烯醇 标准 工作液，分 别准 确吸 取脱 氧雪腐 镰刀 菌烯 醇标 准中 间液(4.9)适量，用水配制 成1 g/mL、2 g/mL、5 g/mL、10 g/mL、20 g/mL 系 列标 准工 作 液。5 仪器和 设备 5.1 高效液 相色 谱仪，配 有紫 外检测 器。5.2 粉碎机。5.3 涡旋混 合器。5.4 振荡器。5.5 离心机，转 速不 低 于 5000 r/min。5.6 超声波 清洗 机。5.7 旋转蒸 发仪。5.8 天平，感量 分别 为 0.1 g 和0.01 mg。6 检测步 骤 6.1 样品 饲料原 料或 配合 饲料。6.2 试样制 备 按GB/T 14699.1 采集 有代 表性的 样品，按GB/T 20195 进行试 样的 制备，粉碎，通过0.85 mm 试 验筛，装入密 封的 玻璃 容器 中，低温保 存备 用。6.3 试样提 取 称取试 样25 g（精 确至 0.01 g）置 于250 mL具 塞锥 形 瓶中，准 确加 入100 mL 乙腈-水溶 液（84+16），置于振 荡器 振荡30 min，5000 r/min离心5 min，收 集 上清液 于干 净的 容器 中备 用，取10.0 mL上 清液 置于50 mL 离心管中，加10.0 ml乙 腈饱和正己烷 溶液，涡旋 混合2 min，5000 r/min 离心2 min，弃去正 己烷层后，待 净化。6.4 试样净 化 6.4.1 层析柱 制备：在 层析 柱底 部加入 适量 脱脂 棉，加 入6 ml 乙腈+水溶 液。按下列 顺序 湿法 装柱：DB13/T 2954 2019 3 a)酸性氧 化 铝1g；b)活性 炭0.5g。c)脱脂棉 少量 注：如果其他等效产品具有相 同的效果，则可使用这些等效产品。6.4.2 过柱、洗脱，当 柱内 溶剂 液面降 至上 层脱 脂棉 与活 性炭界 面时，加 入提 取液，控制 流速 为每 秒1 2 滴，待 溶液 全部 过柱 后，用5 mL 乙腈 淋洗 柱子，收集 全部 流出 液于 鸡心 瓶中，于旋 转蒸 发仪 减 压浓缩至 干，加 1 mL 水溶 解 残留物，涡 旋混 匀 1 min，过 0.22 m 微 孔滤 膜于 进 样瓶，待测。6.5 仪器条 件 高效液 相色 谱参 考条 件：a)色谱柱，C18 柱，250 mm4.6 mm，粒 径5 m；b)流动相，甲 醇+乙腈+水（10+10+80），用 前过0.45 m 滤膜，脱 气；c)流速，1 mL/min；d)检测波 长，218 nm；e)柱温，40；f)进样量，50 L。注：当存在干扰峰或需要辅助 定性时，可以采用乙腈+水=8+92 为流动相来测定。6.6 定量测 定 以脱氧 雪腐 镰刀 菌烯 醇标 准工作 液浓 度为 横坐 标，以峰面 积积 分值 为纵 坐标，将系 列标 准溶 液 由低到高 浓度 依次 进样 检测，得到 标准 工作 曲线。试样液 中待 测物 的响 应值 应在标 准曲 线线 性范 围内，超过 线性 范围 则应 适当 稀释处 理后 再进 样 分析。7 结果计 算 所得实 验数 据按 公式（1）计算。=m10 V(1)式中：供试 试料 中脱 氧雪 腐镰刀 菌烯 醇 的含 量，单位为 微克 每千 克（g/kg）；试 样溶 液中 脱氧 雪腐 镰刀菌 烯醇 的 浓度，单 位微克 每毫 升（g/mL）；V 样液 最终 定容 体积，单位 毫升（mL）；m 试样 的称 样量，单 位为克（g）；1000。平行测 量结 果用 算术 平均 值表示，结 果保 留到 小数 点后一 位。8 准确度 和精 密度 8.1 重复性 在重复 条件 下，获得 的两 次独立 测试 结果 的绝 对差 值不超 过这 两个 测定 值的 算术平 均值 的15%。DB13/T 2954 2019 4 8.2 再现性 在再现 条件 下，获得 的两 次独立 测试 结果 的绝 对差 值不超 过这 两个 测定 值的 算术平 均值 的20%。8.3 回收率 本方法 的回 收率 为80%110%。_