D B 2 1/T 3 8 4 8 2 0 2 3I C S 6 7.1 2 0.3 0C C S B 5 0DB21辽 宁 省 地 方 标 准D B 2 1/T 3 8 4 8 2 0 2 3中 华 小 长 臂 虾 种 质 鉴 定 规 范S p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n o f P a l a e m o n e t e s s i n e n s i s2 0 2 3-1 0-3 0 发 布 2 0 2 3-1 1-3 0 实 施辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 2 1/T 3 8 4 8 2 0 2 3I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利，本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 辽 宁 省 农 业 农 村 厅 提 出 并 归 口。本 文 件 起 草 单 位：沈 阳 农 业 大 学。本 文 件 主 要 起 草 人：李 应 东、赵 莹 莹、李 晓 东、魏 华、胡 清 彪、姜 宏 波、邢 跃 楠、包 杰、丰 程 程、于 业 辉。本 文 件 发 布 实 施 后，任 何 单 位 和 个 人 如 有 问 题 和 意 见 建 议，均 可 以 通 过 来 电 和 来 函 等 方 式 进 行 反 馈，我 们 将 及 时 答 复 并 认 真 处 理，根 据 实 际 情 况 依 法 进 行 评 估 及 复 审。归 口 管 理 部 门 通 讯 地 址：辽 宁 省 农 业 农 村 厅（沈 阳 市 和 平 区 太 北 原 街 2 号），联 系 电 话：0 2 4-2 3 4 4 7 8 6 2。文 件 起 草 单 位 通 讯 地 址：沈 阳 农 业 大 学（沈 阳 市 沈 河 区 东 陵 路 1 2 0 号），联 系 电 话：0 2 4-8 8 4 8 7 1 4 6D B 2 1/T 3 8 4 8 2 0 2 31中 华 小 长 臂 虾 种 质 鉴 定 规 范1 范 围本 文 件 规 定 了 中 华 小 长 臂 虾（P a l a e m o n e t e s s i n e n s i s）的 学 名 与 分 类、生 物 学 特 征、生 长 与 繁 殖、遗 传 学 特 性、检 测 方 法 与 检 验 判 定 规 则。本 文 件 适 用 于 中 华 小 长 臂 虾 的 种 质 鉴 定。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B/T 1 8 6 5 4.1 养 殖 鱼 类 种 质 检 验 第 1 部 分：检 验 规 则G B/T 1 8 6 5 4.2 养 殖 鱼 类 种 质 检 验 第 2 部 分：抽 样 方 法G B/T 1 8 6 5 4.4 养 殖 鱼 类 种 质 检 验 第 4 部 分：年 龄 与 生 长 的 测 定G B/T 1 8 6 5 4.6 养 殖 鱼 类 种 质 检 验 第 6 部 分：繁 殖 性 能 的 测 定G B/T 1 8 6 5 4.1 2 养 殖 鱼 类 种 质 检 验 第 1 2 部 分 染 色 体 组 型 分 析G B/T 1 8 6 5 4.1 4 养 殖 鱼 类 种 质 检 验 第 1 4 部 分 D N A 含 量 的 测 定S C/T 1 1 0 2-2 0 0 8 虾 类 性 状 测 定3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义。4 学 名 与 分 类4.1 学 名中 华 小 长 臂 虾（P a l a e m o n e t e s s i n e n s i s）4.2 分 类 地 位属 甲 壳 纲（C r u s t a c e a）十 足 目（D e o a p o d a）长 臂 虾 科（P a l a e m o n i d a e）小 长 臂 虾 属（P a l a e m o n e t e s）5 主 要 生 物 学 性 状5.1 外 部 形 态体 透 明，呈 青 色 略 带 微 黄 色。额 剑 短 于 头 胸 甲，平 直 前 伸，上 具 5 齿 6 齿。头 胸 甲 具 触 角 刺、鳃 甲 刺、无 肝 刺、鳃 甲 沟 伸 至 头 胸 甲 中 部 之 前。尾 节 末 端 呈 尖 刺 状，两 侧 各 具 1 大 1 小 两 刺。大 颚 不 具触 须。体 长 2 5 m m 5 0 m m。卵 大，卵 径 为 1.1 8 m m 1.5 0 m m 1.0 0 m m 1.0 4 m m，卵 呈 棕 绿 色。自 头 胸 甲 两 侧 至 第 6 腹 节 均 有 棕 色 或 棕 黑 色 的 条 纹，以 第 3 腹 节 色 最 浓。雌 雄 异 体，雌 性 生 殖 系 统 包 括 卵巢、输 卵 管；雄 性 生 殖 系 统 包 括 1 对 精 囊、输 精 管 和 精 荚 囊。中 华 小 长 臂 虾 外 形 见 图 1。D B 2 1/T 3 8 4 8 2 0 2 32图 1 中 华 小 长 臂 虾 外 形（1.全 形，侧 面；2.尾 节 末 端，背 面；3.第 一 触 角；4.第 二 触 角 鳞 片；5.大 颚）5.2 可 数 性 状额 剑 齿 式：上 额 角 齿 数/下 额 角 齿 数 为 5 6/1 2。5.3 可 量 性 状全 长 比 体 长 的 范 围：1.7 5 9 2.5 3 8。腹 部 长 比 体 长 的 范 围：0.6 6 6 0.7 7 2。全 额 剑 长 比 头 胸 甲长 的 范 围：0.6 1 2 0.9 7 2。6 繁 殖6.1 性 成 熟中 华 小 长 臂 虾 雌 雄 异 体，可 当 年 性 成 熟。6.2 怀 卵 量怀 卵 量 与 个 体 大 小 相 关，一 般 怀 卵 量 在 4 0 粒 2 3 0 粒 不 等，雌 虾 抱 于 腹 肢 上，体 外 授 精。6.3 产 卵 类 型产 卵 期 为 4 月 中 旬 至 7 月 中 旬，沉 性 兼 粘 性 卵。7 遗 传 学 特 性7.1 细 胞 遗 传 学 特 性 检 测7.1.1 染 色 体 数D B 2 1/T 3 8 4 8 2 0 2 33体 细 胞 染 色 体 二 倍 数，2 n=8 8。7.1.2 核 型染 色 体 核 型 公 式 为 2 n=8 8=6 6 m+1 0 s m+4 s t+8 t。中 部 着 丝 粒 染 色 体(m 组)3 3 对；亚 中 部 着丝 粒 染 色 体(s m 组)5 对；亚 端 部 着 丝 粒 染 色 体(s t 组)2 对；端 部 着 丝 粒 染 色 体（t 组）4 对；染 色 体臂 数(N F)1 6 4，见 图 2。图 2 中 华 小 长 臂 虾 染 色 体 分 裂 相 及 核 型7.2 分 子 遗 传 学 特 性7.2.1 中 华 小 长 臂 虾 线 粒 体 1 6 s r R N A 基 因 标 记对 线 粒 体 1 6 s r R N A 基 因 片 段 进 行 扩 增 和 测 序，P C R 引 物 序 列 为 L 1 6 S：C G C C T G T T T A T C A A A A A C A T，H 1 6 S：C C G G T C T G A A C T C A G A T C A C G T，获 得 长 度 为 5 2 3 b p，群 体 内 个 体 间 遗 传 距 离 小 于 2%，序 列 如 下：5-tatgagctattaatataaagtctagcctgcccactgagtaattaaagggctgcagtaatttgactgtgcaaaggtagcataatcagtagtcttttaattgaaggcttgaatgaatggctggatgagggagaaactgtctttttggtaaattaaaatttgacttttaagtgaaaaggcttaaatttattaaggggacgataagaccctataaaacttaatatttatttatattttgtttttaaattttaaataaactttacaaagtttagtatatattttgttggggagacattgacataattaataactgtctaatttaaatgtttatagctattgttattatatgatccttctttgaaggataaaaagagcaagttactttagggataacagcgtaattttttctgagagttcttatcgaagaaaatagttgcgacctcgatgttgaattaaaatttctgttaggtgtagccgtttaacaagtaggtctgttcgaccttttaaattttacatgatttgagttcaaaccggt-37.2.2 中 华 小 长 臂 虾 线 粒 体 C O I 基 因 标 记对 线 粒 体 C O I 基 因 片 段 进 行 扩 增 和 测 序，P C R 引 物 序 列 为 L C O：G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T G G，H C O：T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T C A，获 得 长 度 为 6 7 4 b p，群 体 内 个 体 间 遗 传 距 离 小 于 2%，序 列 如 下：5-atattggcccactatactttgtatttggagcttgagcaggaatagtaggaacttctttaagactactaattcgagctgaacttggacaaccaggcaccttaatcggaaatgatcaaatttacaatgtggttgtaacggcacacgctttcgttataatcttctttgtagtaataccaattataattggtggatttggaaattgacttgtacccctaatgctaggagctcctgatatagcattcccacgtataaataacataagattttgactcctccccccttctttaacactcattctttctagaggtatagtagaaagaggagtcggaactggttgaacggtttaccctcccctagcgagagggttaggccacgctggagcttcggtagacctgggtattttctctttacatttagcaggagtgtcttctattttgggtgctgtaaatttcattacaactgtaattaatatacgagctccgggaataactatggaccgaactccactttttgtatgagcagtttttttaactgctattttattactactttctctacctattttagcaggggctattactatgcttttaacagaccgaaatctaaatacttctttctttgaccctgctggagggggggatcctattctttatcaacatttattttgatttttt-38 检 测 方 法D B 2 1/T 3 8 4 8 2 0 2 348.1 抽 样 方 法按 G B/T 1 8 6 5 4.2 执 行。8.2 性 状 检 测按 S C/T 1 1 0 2-2 0 0 8 执 行。8.3 年 龄 与 生 长 测 定按 G B/T 1 8 6 5 4.4 执 行。8.4 繁 殖 性 能 测 定按 G B/T 1 8 6 5 4.6 执 行。8.5 染 色 体 检 测按 G B/T 1 8 6 5 4.1 2 的 规 定 执 行。8.6 D N A 含 量 测 定按 G B/T 1 8 6 5 4.1 4 执 行。8.7 分 子 遗 传 学 标 记 方 法8.7.1 D N A 的 提 取取 尾 部 肌 肉，剪 碎 组 织，加 2 0 0 L 裂 解 液（E D T A(p H 8.0)：2 0 0 m m o l/L；S D S：1；P r o t e i n a s e K：2 0 0 g/m L）5 0 温 育 3 h 4 h；加 入 等 体 积 饱 和 苯 酚、氯 仿、异 戊 醇 混 合 液（体 积 比 2 5：2 4：1）4 0 0 L 抽 提，8 0 0 0 r/m i n，离 心 2 0 m i n 后，取 上 清 液，再 重 复 抽 提 2 次；在 上 清 液 中 加 入 2 倍 体 积 的 无 水乙 醇 沉 淀，2 0 静 置；1 2 5 0 0 r/m i n，离 心 2 0 m i n，用 7 0 乙 醇 洗 沉 淀 2 次，晾 干，加 入 5 0 L 的1 T E（p H 8.0）溶 解。使 用 D N A 定 量 仪 测 定 样 品 D N A 的 纯 度 和 浓 度。-2 0 保 存 备 用。8.7.2 P C R 扩 增 反 应8.7.2.1 扩 增 反 应 总 体 积 为 1 5 L，其 中 包 括 摸 板 D N A 5 0 n g、1 0 b u f f e r 1.5 L，M g2+(2 5 m m o l L-1)1.5 L、d N T P S（1 0 m m o l L-1)各 0.2 5 L、T a q 酶 1 U、上 下 游 引 物(1 0 m o l L-1)各 0.1 5 L（1 6 S r R N A，C O I 和 微 卫 星 D N A 法 分 别 使 用 各 自 的 引 物）。8.7.2.2 线 粒 体 1 6 S r R N A 基 因 法 反 应 程 序 为 9 5 预 变 性 5 m i n；9 4 变 性 3 0 s、5 2 退 火 3 0 s、7 2 延 伸 3 0 s，3 5 个 循 环，7 2 延 伸 1 0 m i n。8.7.2.3 线 粒 体 C O I 基 因 法 反 应 程 序 为 9 5 预 变 性 5 m i n；9 4 变 性 3 0 s、5 5 退 火 3 0 s、7 2 延 伸3 0 s，3 5 个 循 环；7 2 延 伸 5 m i n。8.7.2.4 扩 增 反 应 结 束 后，取 5 L 产 物 与 1 L 上 样 缓 冲 液 混 合 点 样，1%琼 脂 糖 凝 胶 中 电 泳 2 0 m i n，电 压 1 2 0 v，紫 外 灯 下 观 察 结 果 并 拍 照 记 录。P C R 产 物 纯 化 后 双 向 测 序。8.7.3 结 果 分 析8.7.3.1 线 粒 体 1 6 S r R N A 基 因 法：测 序 后 进 行 序 列 比 对，群 体 内 个 体 间 遗 传 距 离 小 于 2%。8.7.3.2 线 粒 体 C O I 基 因 法：测 序 后 进 行 序 列 比 对，群 体 内 个 体 间 遗 传 距 离 小 于 2%。9 检 验 与 判 定 规 则D B 2 1/T 3 8 4 8 2 0 2 35检 验 规 则 按 G B/T 1 8 6 5 4.1 执 行，检 测 结 果 符 合 本 文 件 4、5、6、7 及 8.7.3 条 规 定，判 定 为 中 华小 长 臂 虾。D B 2 1/T 3 8 4 8 2 0 2 36附 录 A（资 料 性）中 华 小 长 臂 虾 可 量 性 状 比 例表 A.1 所 示 了 不 同 组 别 中 华 小 长 臂 虾 可 量 性 状 比 例。表 A.1 不 同 组 别 中 华 小 长 臂 虾 可 量 性 状 比 例项目 I 组 I I 组 I I I 组 I V 组全长体长 2.0 3 1 0.2 7 2 2.1 4 3 0.1 8 2 2.3 6 6 0.1 7 2 2.1 0 9 0.2 0 0头胸甲长体长 0.2 7 9 0.0 1 7 0.2 7 8 0.0 1 6 0.2 8 3 0.0 1 7 0.2 9 1 0.0 3 3头胸甲宽体长 0.1 7 2 0.0 1 5 0.1 6 5 0.0 1 1 0.1 5 1 0.0 1 3 0.1 6 6 0.0 1 5头胸甲高体长 0.1 9 9 0.0 1 5 0.1 9 4 0.0 1 2 0.1 7 9 0.0 1 4 0.2 0 2 0.0 1 7腹部长体长 0.7 1 5 0.0 4 9 0.7 0 8 0.0 2 8 0.7 1 6 0.0 5 6 0.6 9 2 0.0 3 7腹部宽体长 0.1 4 6 0.0 1 1 0.1 4 0 0.0 1 8 0.1 3 4 0.0 1 1 0.1 4 1 0.0 1 5腹部高体长 0.1 6 7 0.0 1 7 0.1 6 1 0.0 1 3 0.1 6 4 0.0 1 4 0.1 6 2 0.0 1 7尾扇长体长 0.2 0 4 0.0 1 6 0.2 0 5 0.0 1 5 0.2 0 3 0.0 2 2 0.1 8 9 0.0 2 1尾节高体长 0.0 7 4 0.0 0 7 0.0 7 5 0.0 0 7 0.0 7 1 0.0 0 7 0.0 7 7 0.0 1 1额剑长头胸甲长 0.7 5 3 0.0 7 2 0.7 2 8 0.0 7 4 0.8 9 6 0.0 7 6 0.7 0 8 0.0 9 6头胸甲宽头胸甲长 0.6 1 8 0.0 5 0 0.5 9 4 0.0 4 4 0.5 3 3 0.0 4 5 0.5 7 5 0.0 6 9头胸甲高头胸甲长 0.7 1 4 0.0 5 0 0.7 0 1 0.0 4 4 0.6 3 4 0.0 5 2 0.6 9 8 0.0 7 3腹节宽头胸甲宽 0.8 5 5 0.0 7 9 0.8 5 5 0.1 1 2 0.8 9 4 0.0 9 0 0.8 5 6 0.1 0 5眼窝距头胸甲宽 0.3 2 7 0.0 6 2 0.3 4 5 0.0 3 7 0.0 3 2 0.0 0 4 0.0 5 4 0.0 1 2腹节高头胸甲高 0.8 4 4 0.0 8 2 0.8 3 1 0.0 7 2 0.9 1 8 0.0 9 5 0.8 1 0 0.0 9 9尾节高头胸甲高 0.3 7 5 0.0 3 9 0.3 8 8 0.0 3 9 0.3 9 9 0.0 5 0 0.3 8 5 0.0 5 7腹部宽腹部长 0.2 0 5 0.0 1 3 0.1 9 9 0.0 2 5 0.1 8 8 0.0 1 9 0.2 0 4 0.0 2 2腹部高腹部长 0.2 3 4 0.0 2 0 0.2 2 8 0.0 1 7 0.2 3 0 0.0 2 5 0.2 3 5 0.0 2 4_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 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