DB53/T 9392019 家畜体细胞系建立与冷冻保存 2019-09-23发布 2019-12-23实施ICS 65.020.30 B 40 云南省地方标准 云南省市场监督管理局 发布 DB53/T 9392019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由云南省农业厅提出。本标准由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。本标准起草单位：云南省畜牧兽医科学院。本标准主要起草人：洪琼花、吕春荣、权国波、邵庆勇、吴国权、欧阳依娜、杨红远。DB53/T 9392019 1 家畜体细胞系建立与冷冻保存 1 范围 本规程规定了家畜体细胞系建立、冷冻保存方法、细胞系命名。本规程适用于猪、牛、羊、马等家畜体细胞系建立、冷冻保存与细胞系命名。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 原代培养 是指直接从家畜组织或器官，将其分散成细胞后开始的培养。2.2 细胞系 指原代细胞培养物经首次传代成功后所增殖的细胞群体，可泛指一般可能连续传代的细胞。3 工作区条件 洁净环境下，无菌操作。4 体细胞系的建立 4.1 试剂 无钙、镁的磷酸缓冲盐溶液，含有4.00mM L-谷氨酰胺，4500 mg/L葡萄糖的高糖DMEM，胎牛血清，1%双抗，蛋白酶乙二胺四乙酸：0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA），二甲基亚砜（DMSO）。4.2 培养液 高糖DMEM，10%15%胎牛血清，1%双抗。4.3 样品采集、保存与运输 4.3.1 采样个体选择 选取系谱清楚、生长发育良好、健康无病的青幼年个体。4.3.2 采集耳缘组织样本 采集耳缘组织按以下步骤进行：DB53/T 9392019 2 a)先刮净采样部位耳毛，再用碘酒、75%的酒精消毒。b)用消毒过的采样工具采取样品。c)样品放入 5 mL10 mL 备有培养基的离心管中，并封口。d)标记样品名称、性别、年龄、采样地点、采样部位、个体编号及采样时间等信息，记录表参见附录A 中表A.1。4.3.3 样品保存与运输 样品放入4 的采样箱后应于48 h内带回实验室进行原代培养。4.4 细胞培养 4.4.1 培养条件 在5%CO2、饱和湿度、37.0 培养箱中进行培养。培养液变黄时应更换培养液，再继续培养。4.4.2 原代培养 原代培养按以下步骤进行：a)无菌耳缘组织在75%的酒精中浸泡1 min2 min，用含1%双抗的PBS反复洗涤3次，每次5 min。b)用眼科剪剪成 1 mm3左右的碎块，置于培养瓶（皿）中进行组织块贴壁培养。c)用消毒过的采样工具采取样品。d)组织贴壁稳定后，加入培养液继续培养。4.4.3 传代培养 传代培养按以下步骤进行：a)待细胞增殖至培养瓶（皿）底壁的 80%85%时，弃除培养液，添加细胞消化液在 37.0 消化3 min5 min。b)显微镜观察，成纤维细胞由梭形变为圆形时立即添加培养液终止消化，制成细胞悬液。c)将细胞悬液移至离心管中，经 1 000 g/min 离心 5 min 后弃上清，加入 PBS 于相同条件下离心清洗后，用培养液重悬细胞，用血球计数板或细胞计数仪计数细胞，调整细胞密度在 1.0105 个/mL 对细胞进行传代培养。5 冷冻保存 5.1 冷冻保存液 高糖DMEM，10%二甲基亚砜（DMSO），20%30%胎牛血清。5.2 细胞冷冻保存 原代细胞和传代细胞均可用于冷冻保存，冷冻保存按以下步骤进行：a)将培养细胞制成单细胞悬液，并计数，使其密度在 1.0106 个/mL3.0106 个/mL。b)按 1 mL/每管分装在冻存管中，标明细胞名称、冻存管编号、性别、冻存日期、代次。c)投入液氮（-196）保存，并做好相应记录，记录表参见附录 A 中表A.2。5.3 细胞复苏 细胞复苏按以下步骤进行：DB53/T 9392019 3 a)从液氮中取出细胞冻存管，放入 40 水浴中不断摇动 1 min 取出，用70%酒精消毒冻存管。b)吸出细胞悬液，放入离心管中，加入 10 倍体积的细胞培养液，混合后 1 000 g/min 离心5 min，弃上清，再重复清洗一次。c)对复苏后的细胞进行接种，接种密度以 5105/mL 为宜。6 细胞系的命名 细胞系命名采用6级命名法，按以下步骤进行：a)中文名由采样的物种、品种、性别、采样组织、细胞系编号、培养代数组成。b)其缩写名则由物种英文名称的字首、品种名头两个字拼音字首、性别（公为 11、母为 12）、采样组织的英文的字首、细胞系编号（用阿拉伯数字表示）、培养代数（F0-FN）组成。c)如从撒坝公猪耳缘组织采样所建立的成纤维细胞系 1 第1代细胞，其中文名为“撒坝公猪耳缘成纤维细胞系 1 第1 代细胞”，缩写名为“PSb11E1F1”，命名表参见附录 A 中表A.3。DB53/T 9392019 4 附 录 A（资料性附录）采样记录表、细胞冻存记录表、细胞系命名表 A.1 采样记录表 采样记录表见表A.1。表A.1 采样记录表 物种 品种 年龄 性别 采样地点 采 样 记 录 采样部位 记录人：A A.2 细胞冻存记录表 细胞冻存记录表见表A.2。表 A.2 细胞冻存记录表 细胞系名称 冷冻日期 操作者 冻存容器编号 冷冻袋号码 每个冻存管的冻存量（mL）冻存信息 冻存管的总数（个）记录人：B A.3 细胞系命名表 细胞系命名见表A.3。表A.3 细胞系命名表 中文名 物种 品种 性别 采样组织 细胞系编号 培养代数 缩写名 英文名字首 头两个字拼音字首 公为11、母为 12 英文字首 阿拉伯数字 F0-FN _ DB53/T 9392019