ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 24102015 鸭坦布苏病毒抗体检测技术规程 Technical Regulation for Detection of Antibody against Duck Tembusu Virus 文稿版次选择 2015-07-14 发布 2015-08-14 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 24102015 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省农业委员会提出。本标准起草单位：安徽农业大学动物科技学院、安徽省动物疫病预防与控制中心、宣城市动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人：王桂军、朱良强、耿照玉、占松鹤、刘红梅、祁克宗、程帮照、刘雪兰、徐前明、王军、周迎春、张永宜。DB34/T 24102015 1 鸭坦布苏病毒抗体检测技术规程 1 范围 本标准规定了应用琼脂免疫扩散技术检测鸭坦布苏病毒抗体的方法。本标准适用于鸭坦布苏病毒的抗体检测，用于对该病的诊断、检疫和疫情监测。2 检测材料 2.1 试验仪器 电子天平（0.001 g）微波炉 37恒温培养箱 琼脂凝胶梅花打孔器 移液器 2.2 TAE缓冲液（50）：a)经基甲基氨基甲烷（Tris)242 g b)冰乙酸 57.1 mL c)0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0)100 mL d)灭菌双蒸水 加至 1000 mL e)用时用双蒸水稀释 50 倍，配制成 1TAE 缓冲液。2.3 标准抗原和阳性血清 鸭坦布苏病毒琼脂扩散抗原由坦布苏病毒病毒安徽分离株 AH-F10 株（CCTCC V201213）经甲醛灭活制备而成。阳性血清由坦布苏病毒病毒安徽分离株 AH-F10 株（CCTCC V201213）制备油佐剂灭活制剂免疫健康鸭，分离血清制备而成。3 检测 3.1 采血 用一次性注射器从待检鸭翅静脉无菌采血 2 ml。3.2 分离血清 静止血样，待血液凝固后，离心，分离上层血清待检。3.3 琼脂糖凝胶板的制备 DB34/T 24102015 2 用 1TAE 缓冲液配置 1琼脂糖，微波炉中煮沸溶解，冷却至 60左右，倒入平皿（直径 9 cm）中制作琼脂糖凝胶板，琼脂糖凝胶厚度约 4 mm，完全凝固后备用。3.4 打孔 用梅花打孔器在上述琼脂糖凝固板上打孔，孔径 5 mm、孔距 3 mm。打孔结束后，取适量 1琼脂糖封底，以避免血样渗漏。3.5 加样 用移液器在中间孔加入 DTMUV 标准抗原，1 号、4 号孔加入阳性血清，2、3、5、6 号孔加入待测血清。每孔血清加满，不可溢出。如图1 所示：图1 完成加样后，将琼脂板倒置放入湿盒内，置于 37培养箱中 2448 h。4 结果判定 在标准抗原孔与阳性血清孔中间形成一条清晰的沉淀带时，才能进行结果判定。观察时，可在黑色背景衬托下进行判定。4.1 阳性结果 被检血清孔与标准抗原孔之间形成一条致密沉淀带，并与阳性对照沉淀带平滑相连，即可判断为阳性。4.2 阴性结果 被检血清孔与标准抗原孔之间无沉淀带出现；出现的沉淀带与阳性对照交叉或者不相连，为非特异性反应，也判定为阴性。4.3 可疑 被检血清孔与标准抗原孔之间沉淀带不清晰，应予以重测，重测结果相同，即判为阳性。重测结果无沉淀带判为阴性。_ 123465 阳性血清 标准抗原 待测血清