ICS 65.020 B 62 DB41 河南省地方标准 DB41/T 11032015 太行菊组 织培养技 术规程 2015-08-13 发布 2015-11-13 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 11032015 I 前 言 本标准 按照 GB/T 1.12009 给出的 规则 起草。本标准 由河 南省 林业 标准 化技术 委员 会提 出并 归口。本标准 起草 单位：郑 州大 学、河 南省 绿洲 园林 有限 公司。本标准 主要 起草 人：史屹 峰、黄 进勇、张 建波、刘 彬、赵 志营、王 景玉、李 娇。本标准 参加 起草 人：崔青 艳、韩 玉霞、乔 林、张献 计、王 俊、复鹏、田 小娟、李幸 红、岳彩 鹏、朱世新。DB41/T 11032015 1 太 行菊组 织培养技 术规程 1 范围 本标准 规定 了太 行菊 组织 培养的 术语 和定 义、培养 基的配 制、组织 培养、炼 苗移栽。本标准 适用 于太 行菊 组织 培养。2 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 太行菊 太行菊(Opisthopapus taihangensis)，菊 科菊 蒿亚 族太行 菊属 多年 生宿 根草 本植物，中国太 行山 区特有珍稀 物种。3 培养基 的配 制 3.1 培养基 选择 选择MS 培养 基为 基本 培养 基（MS 培养 基参 见附 录A）。3.2 母液与 激素 的配 制 3.2.1 大量元 素母 液的 配制 大量 元素 母液 按 50 倍配 制。使用时 再稀 释 50 倍，配好的 母液 放置 于棕 色瓶 保存 于 4冰箱 中备 用。3.2.2 微量元 素母 液的 配制 微量 元素 母液 按 100 倍配 制。使用 时再 稀释100 倍，配 好的 母液 放置 于棕色瓶 保存 于 4 冰 箱中 备用。3.2.3 有机母 液的 配制 有机母 液按100 倍配 制。使 用时再 稀释100 倍，配好 的 母液放 置于 棕色 瓶保 存于4 冰箱 中备 用。3.2.4 铁盐母 液的 配制 分别溶 解FeSO47H2O 和 Na23.2.5 6-苄氨 基腺 嘌呤 配制-EDTA，加 热并 不断 搅拌，使完 全溶 解，冷却 后，将2 种溶 液混 合，再用蒸溜 水加至 所需 容积，按100倍配制。使用 时再 稀释100倍，配 好的母 液放 置 于棕色 瓶保存 于4冰箱中备用。称取 100mg 6-苄氨 基腺嘌呤（6-BA），用 少量 0.1mol/L HCL 加热 溶解，再用蒸 馏水 定容 至 100mL,DB41/T 11032015 2 浓度 为 1.0mg/L。3.2.6 萘乙酸 配制 称取 10mg 萘乙 酸（NAA），用 1mL 无水乙 醇溶 解，再 用蒸 馏水 定容 至 100mL，浓度 为 0.1mg/L。3.3 培养基 配方 3.3.1 1/2 MS 基本培 养基：1/2 MS+30g/L 白砂 糖+10g/L 琼 脂条；3.3.2 丛生芽 诱导 培养 基：MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+30g/L 白砂 糖+10g/L 琼脂 条；3.3.3 生根培 养基：1/2 MS+0.2mg/L NAA+30g/L 白砂 糖+10g/L 琼脂条；3.3.4 无激素 基本 培养 基：MS+30g/L 白砂糖+10g/L 琼脂条。3.4 配制 以配 制 10L 培养 基为 例，按顺序 进行 如下 操作：a)MS 为 基本 培养 基，取少 量蒸馏 水倒 入容 器内，除 了大量 元素 母液 取 200mL 外，其 余母 液均取100mL 倒入容器 内；1/2 MS 为基本 培养 基时；取 少量 蒸馏水 倒入 容器 内，除了 大量元 素母 液 取100mL 外，其余 母液 均取50mL 倒入容 器内；b)称取300g 蔗糖 倒入 容器，搅拌 溶解；c)加蒸 馏水 定容 至 10L；d)按照 培养 基配 方，加入NAA 和6-BA。丛 生芽 诱导 培养基 加 10mL NAA 和 100mL 6-BA；生根 培养基加 20mL NAA；e)称取100g 琼脂 条，倒入 上面配 好的 溶液 中，放在 电炉上 加热 至沸 腾，直到 琼脂条 熔化；f)稍微 冷却 后，用精 密试 纸或酸度 计调 整 pH 至5.7 5.8，分装；g)对分 装好 的培 养基 用高 温高压蒸 汽消 毒，压 力 1.1kg/cm24 组织培 养、温 度 121 条 件下 保持 25min，待 灭菌完成 好，压力 为0 的时 候取出 培养 基，平放 在地 面上冷 却凝 固。4.1 培养材 料及 消毒 4.1.1 培养材 料的 选择 和确 定 10月底 至11 月初，采 集当 年饱满 太行 菊的 种子 作为 培养材 料，存放 于4 冰 箱。4.1.2 消毒灭 菌 将种子 用自来 水冲 洗2h后，在超 净工作 台内 用75%酒 精漂洗15s，后用2%的次 氯酸钠浸 泡8min（加2滴聚山 梨酯），蒸馏 水冲 洗23 次。4.2 无菌播 种 用无菌 滤纸把 种子 表面附 着的水 分吸干 净，然后在 在超净 工作台 内用 镊子将 种子接 种到1/2MS 培养基上，置入温 度为2025 光照 培养 室内诱 导种 子 萌发，待种子 发芽 长出2 片 真叶，进行光 照处 理，光照强 度2500lx，光 照时 间14h/d，培养30d 35d。4.3 诱导及 分化 DB41/T 11032015 3 切除长 出来 的无 菌幼 苗根 部部分，把 得到 的无 菌苗 茎接种 到丛 生芽 诱导 培养 基上，放到 光照 培 养 室培养30d。4.4 增殖继 代培 养 将诱导 出来 的丛 生芽 分割 成含2 3个小芽 的芽 丛，切去死 叶和 基部 黄褐 色疏 松组织，继续接 种到丛生芽诱 导培 养基 上，放置 于光照 培养 室进 行增 殖继 代培养，30d 为一个 周期，如此循 环。4.5 培养环 境 温度为251，光照 时间14h/d，光照 强度2500lx,相对 湿度70%80%。4.6 生根培 养 4.6.1 生根苗 的选 择 从组培 苗中 切取 生长 健壮、叶色 正常、叶 片舒 展的 无根苗。4.6.2 诱导生 根 在超净 工作台 内，将无根 苗上长 至4cm 以上的 再生 芽 从基部 切下，接种 到生根 培养基 上，诱 导根 原基的形 成，黑暗 培养3d5d。后 将其 接种 到无 激素MS培养基 诱导 根的 伸长，光 照培养20d 25d。5 炼苗移 栽 5.1 炼苗 待根长 至3cm 时 开始 炼苗，将培养 瓶放 置温 室自 然散 射光下，温度 控制 在25 1，闭口 炼苗2d 3d，再 打开 瓶盖，加 入3mL800倍多菌 灵溶 液，炼苗3d5d。5.2 移栽 用镊子 将生 根苗 从培 养瓶 中取出，洗 去基部培 养基，在800 倍多 菌灵 溶液 中浸 泡30min 后移 栽到 基质中。基 质采 用草 炭土、蛭石、珍珠 岩比 例为3:1:1。温 度251，前3d4d相对湿度 保持 在80%90%，后逐渐 降低 湿度，每 天叶 面喷水23 次，当试 管苗 根系发 达、形成 侧须 根后，可移 栽到 花盆 中。DB41/T 11032015 4 A 附 录 A（资料 性附 录）MS 培养基 成分 表 MS培养 基成 分 见 表A.1。表A.1 单位为毫克每升 成分 含量 大量元素 硝酸钾（KNO3 1900)硝酸铵（NH4NO3 1650)磷酸二氢钾（KH2PO4 170)硫酸镁（MgSO47H2 370 O)氯化钙（CaCl22H2 440 O)微量元素 碘化钾（KI)0.83 硼酸（H3BO3 6.2)硫酸锰（MnSO44H2 22.3 O)硫酸锌（ZnSO47H2 8.6 O)钼酸钠（Na2MoO42H2 0.25 O)硫酸铜（CuSO45H2 0.025 O)氯化钴（CoCl26H2 0.025 O)铁盐 乙二胺四乙酸二钠（Na2 37.25-EDTA)硫酸亚铁（FeSO47H2 27.85 O)有机 肌醇 100 甘氨酸 2 盐酸硫胺素（VB1 0.1)盐酸吡哆醇（VB6 0.5)烟酸（VB5 0.5)B _