ICS 65.020.30 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 18422014 山羊支原体山羊肺炎亚种 PCR 检测技术规范 2014-09-19发布 2014-10-01实施四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 18422014 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 设备和试剂.1 5 DNA提取.2 6 PCR扩增.2 7 PCR 产物的电泳检测.3 8 结果判定.3 9 废弃物无害化处理.3 附录 A（规范性附录）相关试剂的配制.4 DB51/T 18422014 II 前 言 本标准附录A为规范性附录。本标准由四川省农业厅提出。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：西南民族大学。本标准主要起草人：杨发龙、张焕容、王远微、岳华、汤承、张斌、任玉鹏。DB51/T 18422014 1 山羊支原体山羊肺炎亚种 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了山羊支原体山羊肺炎亚种的PCR检测方法。本标准适用于山羊支原体山羊肺炎亚种的检测与鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB T6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 兽医实验室生物安全技术管理规范（2003农业部公告第302号）3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。3.1 山羊支原体山羊肺炎亚种 Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae 属于柔膜体纲支原体目支原体科支原体属丝状支原体簇的成员，是引起山羊传染性胸膜肺炎（contagious caprine pleuropneumonia,CCPP）的病原，其典型菌株为 F38。3.2 聚合酶链式反应（PCR）Polymerase chain reaction 是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的 DNA片段。4 设备和试剂 4.1 主要仪器和设备 4.1.1 PCR 扩增仪 4.1.2 电泳仪、水平电泳槽 4.1.3 凝胶成像系统 4.1.4 冷冻高速离心机 4.1.5 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作）4.1.6 高压灭菌锅 4.1.7 恒温水浴锅 4.1.8 移液器（0.1 L10 L、2 L20 L、20 L200 L、200 L1000 L）DB51/T 18422014 2 4.2 主要试剂 4.2.1 引物（10 mol/L）P1：5-A TCA TTTTTAA TCCCTTCAAG-3 P2：5-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA-3 扩增片段大小为 316 bp。4.2.2 DNA 提取试剂：蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠（SDS）、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。4.2.3 PCR 反应试剂：Taq DNA 聚合酶（5 U/L）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（每种浓度为 2.5 mmol/L）、10PCR Buffer(无Mg2+)。4.2.4 STE 缓冲液（见附录 A）4.2.5 TAE 电泳缓冲液（见附录 A）4.2.6 6上样缓冲液（6Loading Buffer）4.2.7 琼脂糖（电泳级）4.2.8 核酸染料(Goldview)4.2.9 DNA 分子量标准 4.2.10 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水（三蒸水）规格。4.2.11 阳性对照：标准参考菌株作为阳性对照。4.2.12 阴性对照：用 GB/T 6682 中三级水代替 PCR 扩增模板作为阴性对照。5 DNA 提取 5.1 样本处理 5.1.1 组织样本：肺等组织样本，按 1 g加入 1 mL 的STE 缓冲液，剪碎并研磨，3000 r/min 进行离心 10 min，取上清液，12000 r/min进行离心 20 min，弃上清，沉淀用于 DNA 提取。5.1.2 鼻腔拭子样本：将鼻腔拭子浸入 1 mL 的STE 缓冲液中 30 min，充分涮洗，贴管壁挤干拭子，12000 r/min离心 20 min，弃去上清，收集沉淀用于 DNA 提取。5.1.3 胸腔渗出液：取 500 L胸腔渗出液，加入500 L STE 缓冲液，混匀，12000 r/min 离心 20 min,弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。5.1.4 液体培养物：取 1mL 液体培养物,12000 r/min 离心 20 min,弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。5.1.5 对照样本：阴阳性对照样本处理与检测样本处理方法相同。5.2 DNA提取方法 5.2.1 向上述沉淀中加入 500 L STE 缓冲液，振荡重悬。5.2.2 加入 10%SDS 溶液20 L，20mg/mL 蛋白酶 K 10 L，混匀，在 56水浴60 min。5.2.3 加入等体积 530 L 的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混合液，混匀，12000 r/min 离心 5 min。5.2.4 定量转移上清液到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合液，颠倒混匀，12000r/min离心5 min。5.2.5 取上清，加入 2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20 沉淀 30 min，12000 r/min 离心 5 min，弃去上清液。5.2.6 用 1 mL 70%乙醇漂洗，12000 r/min离心 5 min，弃上清液。5.2.7 室温干燥，DNA 沉淀用 25 L 无菌三蒸水溶解作为模板，-20 保存备用。6 PCR 扩增 DB51/T 18422014 3 6.1 PCR 反应体系 总反应体系 25 L，包括以下成份：10PCR Buffer 2.5 L、MgCl2（25 mM）2 L、dNTP(2.5 mM)2 L、TaqDNA 聚合酶(5 U/L)0.15 L、引 物 P1（10 mol/L）1 L、引 物 P2（10 mol/L）1 L、水 14.50 L、模板 DNA 2 L。PCR 扩增设置阳性。6.2 PCR 反应条件 94 预变性 3 min，然后进行 94 30 s,47 30 s,72 30 s 的循环，进行 35 个循环，最后 72 延伸 10 min，4保存。7 PCR产物的电泳检测 7.1 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 1）。7.2 取 5 L PCR 产物与 1 L 6上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔中加入 DNA分子量标准，以 5 V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。8 结果判定 8.1 阳性对照出现一条 316 bp 大小的条带，且阴性对照不出现条带。8.2 在满足 8.1的条件下，被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条 316 bp 的条带判定为阳性（+），即样本中含有山羊支原体山羊肺炎亚种 DNA；被检样品的 PCR 产物经电泳后不出现 316 bp 的条带判定为阴性（-）。9 废弃物无害化处理 按GB 16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理。废弃物实行无害化处理。DB51/T 18422014 4 A A 附 录 A（规范性附录）相关试剂的配制 A.1 STE缓冲液 0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0)1 mmol/L EDTA(pH8.0)A.2 TAE电泳缓冲液（pH8.0）50TAE 电泳缓冲液贮存液：Tris 碱 242 g EDTA 37.2 g 冰乙酸 57.1mL 加双蒸水至 1000 mL，应用前用双蒸水将 50TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。A.3 1%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 1 g 1TAE电泳缓冲液 100 mL 将琼脂糖放入TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60 左右时加入5 L的核酸染料，混匀，均匀倒板，厚度为3 mm5 mm。_ DB51/T 18422014