ICS 65.020.30 B45 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3317 2018 鸡白血病多重 PCR 和斑点杂交检测方法 Laboratory detection technologies of multi-PCR and dot hybridation for diagnosis of Avian leukosis(AL)2018-06-12 发布 2018-07-12 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3317 2018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1 给出的规 则起草。本标准由山 东省畜牧 兽医局提 出。本标准由山 东省畜牧 业标准化 技术委员 会归口。本标准主要 起草单位：山东农 业大学。本标准主要 起草人：成子强。DB37/T 3317 2018 1 鸡白血病多重 PCR 和斑点杂交检测方法 1 范围 本标 准规定 了我省针 对禽白血 病的诊断 检测技术 的方法。本标准适用 于企、事业单位 禽病诊断 实验ALV-A/B 和ALV-J 的检 测,判断 鸡群是 否患A/B、J 亚群白血病。2 规范性引用 文件 下列文件对 于本文件 的应用是 必不可少 的。凡是注 日期的引 用文件，仅所注日 期的版本 适 用于本文件。凡是不 注日期的 引用文件，其最新 版本（包 括所有的 修改单）适用于本 文件。GB/T 26436 禽白血病 诊断技术 NY/T 680 禽 白血病病 毒p27抗 原酶联免 疫吸附试 验 3 术语和定义 下列术语和 定义适用 于本标准。3.1 禽白血病 Avian Leukosis，AL 反转 录病 毒 科甲 型反 转 录病 毒属 禽 反转 录病 毒 引起 的以 禽 类造 血组 织 中某 些细 胞 成分 过 度增 生为主的可传染 的肿瘤性 疾病，临床症 状主要表 现为嗜睡、食 欲不振、鸡 体消瘦、鸡冠 和肉髯 呈淡紫色，腹部显著增大，胸 骨异常隆 起。根据病 毒囊膜蛋 白的抗原 性差异、病 毒干扰实 验、宿主范 围 等生物学特 性，将禽白血病 肉瘤病毒 群分成A-J共10 个亚群，其中A、B、C、D、E 和J 亚 群的宿 主是鸡，流 行于我国禽 群的主要是A、B和J亚 群。ALV-J 的危 害最为严 重，目前在鸡 群中平均 感染率为10%左右，呈 现间歇性爆 发；ALV-A/B 零星 爆发，平均感染 率在1%左右。J 亚群主 要诱发髓 细胞性白 血病，而A/B亚群 主 要造成淋巴 细胞性白血病 和肉瘤。禽 白血病自 发现以来，发病率 不断呈上 升趋势，在世界各 地均有发 生，呈世界性 分布，是危害 养禽业的 主要疾病 之一。3.2 多重PCR 技术 Multiple polymerase chain reaction，M-PCR 在普通PCR 的 基础上加 以改进,于一个PCR 反应体系 中加入多 对特异性 引物，针 对多个DNA 模 板或同一模板的不同 区域扩增 多个目的 片段的PCR 技术。3.3 斑点分子杂 交技术 dot blotting 是直接从待 检鸡只的 组织或 血 液样品提 取DNA,将 变性的DNA 样品点 样于硝酸 纤维素膜 或 尼龙膜上，然后与制备 的特异性 探针进行 杂交来检 测样品中 的前病毒DNA。DB37/T 3317 2018 2 4 试剂或材料 除另有规定 外，所有 化学试剂 均为分析 纯。4.1 常规使用的 商品化的 DNA 提取 试剂盒。4.2 常规使用的 商品化的 RNA 提取 试剂盒。4.3 LB 培养基所需胰 蛋白胨（Rryptone）、酵母 抽提物（Yeast Extract）试 剂。4.4 Multi Hotstart DNA Polymerase(5 U/L)、10 Multi Hotstart Buffer(+Mg2+)、Mgcl2（25 Mm）、Super Pure dNTP(2.5 Mm each)、PCR 琼脂糖 凝胶回收 试剂盒、RNA prep Pure 培养细 胞/细菌总 RNA提取试剂盒。4.5 DL 1000 DNA Marker、PMD 18-T 载 体、6 loading Buffer、PrimeScriptTMRT Master Mix。4.6 禽白血病抗 原检测试 剂盒。4.7 斑点杂交所 需溶液。4.7.1 1 M 马来酸：见附录 A 中 A.1。4.7.2 洗涤缓冲液(马来酸缓 冲液)：见附录 A 中 A.2。4.7.3 显色缓冲液：见附录 A 中 A.3。4.7.4 l M Tris-盐 酸溶液：见附录 A 中 A.4。4.7.5 10%SDS（sodium dodecyl sulfate）溶液：见 附录 A 中 A.5。4.7.6 20 SSC（saline sodium citrate）溶 液：见附录 A 中 A.6。4.7.7 封闭溶液（Blocking 溶液）：见附录 A 中 A.7。4.7.8 抗体溶液：见附录 A 中 A.8。4.7.9 预杂交溶液：见附录 A 中 A.9。4.7.10 杂交溶液：见附录 A 中 A.10。4.7.11 NBT/BCIP 显色液：见附录 A 中 A.11。4.7.12 探针标记和 检测试剂 盒（使用 Roche 公 司产品）。4.7.13 制备探针所 需特异性 引物序列：见附录 B。4.7.14 PT-PCR 扩增条件 见附录 C。5 仪器设备 5.1 各量程移液 枪，PCR 仪，梯度 PCR 仪，紫外分 光光度计。5.2 高速台式冷 冻离心机。5.3 紫外分析仪。5.4 凝胶成像系 统。5.5 MK3 型酶标仪。5.6 恒温摇床。5.7 恒温恒湿箱、立式压 力蒸汽灭 菌器、超 净工作台。5.8 双稳定时电 泳仪、核 酸电泳槽。5.9 超声波细胞 粉碎机。5.10 数显超纯水 机。5.11 全自动雪花 制冰机 5.12 数显恒温水 浴锅。5.13 电热恒温鼓 风干燥箱。5.14 Heal Force 二氧化碳 培养箱。DB37/T 3317 2018 3 5.15 pH 计。5.16 恒温磁力搅 拌器。5.17 三洋超低温 保存箱。5.18 高压灭菌器。5.19 硝酸纤维素 膜或尼龙 膜。5.20 冰箱。6 样品采集 6.1 组织样品 该病主侵器 官是肝、脾、肾，采 集组织样 品时，主要采集 肝脏、脾脏、肾 脏，同时应采 取 有明显病变与健康交 界处的组 织。用无菌 的剪刀和 镊子剪取 待检样品 装入冻存 管，编号，迅速放 入 液氮罐中或 送实验室-80 冰箱备 用。6.2 样品储运 样品采集后，将采集的 样品放入 编号的冻 存管中，迅速投入 液氮罐中 或置于冰 盒中，密 封，送实验室冻存备用。6.3 样品存放 样本采集后 迅速放入 液氮罐中，若需长 期保存应 放在-80 冰箱，但应避免 反复冻融。7 操作方法 7.1 方法概要 7.1.1 多重 PCR 基于ALV-A、ALV-J 的 保守性 基因，合 成了特异 性引物（见附录D），从 混合病 毒中，提 取 了混合病毒的RNA 并逆 转录为cDNA，运用 多重RT-PCR 技术扩 增出545 bp(ALV-J)、692 bp(ALV-A)的 特异性片段。7.1.1.1 ALV-A、ALV-J 的 扩增 将复苏 后的DF-1 细 胞进 行传 代25 cm2的培 养瓶，4 h 后取 保存 于-80 的 病毒 液，经0.22 m 滤器过滤除菌，接种1.5 mL 于细胞，1 h 后弃 病毒液，加入5 mL 的PBS 清洗 后，再加 入1%的DMEM 培养基维持7 d，7 d 后收 集细胞上 清即为扩 增的病毒 液。7.1.1.2 接毒培养细 胞总 RNA 的提取 培养7 d 后的 细胞吸弃 上清后，按照1 mL 每瓶（以 覆盖细胞 瓶底壁为 参考）25%胰酶进 行 消化30 s，倒弃胰酶后 加入PBS 5 mL 清洗细 胞，移入 离心管后 按照1006.2 g离心2 min。将分离的 细 胞用商品化 试剂盒提取RNA，并反转 录成cDNA，保存于-80 超 低温冰箱 中。7.1.1.3 总 RNA 的逆转录反应 先去除RNA中的DNA：5gDNA Eraser Buffer 2 L，gDNA Eraser 1 L，总RNA 1 g,加无RNAse 双蒸水至10 L，42 2 min；然后 进行RNA 的 逆转录：在以上的 液体中加 5 PrimeScriptTMRT Master Mix 2 L,加无RNAse 双蒸水 至20 L，混匀后，37 反应15min，85 5S，然后置于4。7.1.1.4 多重 RT-PCT 体系 见附录E。7.1.1.5 PCR 反应后以 1.5%琼 脂糖凝胶 电泳进行 分析 DB37/T 3317 2018 4 7.1.2 斑点杂交 准备好自制 的特异性 探针，提取 样品DNA，将变性 的DNA 样品 点样于硝 酸纤维素 膜或尼龙 膜 上，然后与制备的特 异性探针 进行杂交，通过观 察出现的 斑点来检 测样品中 的前病毒DNA。7.1.2.1 样品 DNA 的制备 按照DNA 提取 试剂盒说 明书的方 法，提取DNA，并 于4 保 存备用。7.1.2.2 探针目的基 因设计与 合成 用 DNAStar 软件设计 通用探针 和各亚群 探针的目 的基因，送生 物技术 有 限公司合 成ALV p27 部分基因和ALV-J env 部分基 因作为探 针目的基 因。7.1.2.3 核酸探针标 记 a)按照 地高 辛 标记 试 剂盒 的说 明 书对 上 述回 收的 通 用探 针基 因 片断 和 各亚 群探 针 基因 片 段 进行标记。在 Eppenderf 管中，加 1 gDNA 模板，高 压灭菌双 蒸水至 16 L；b)沸腾水浴变 性 10 min，迅速冰 浴 2 min,充分变 性有利于 标记；c)将混合地高 辛引物 4 L，至变 性的 DNA 中，离心 313g；d)孵化 37，24 h，时间延长 会增加标 记产物；e)加 2 L 0.2 M EDTA(pH=0.8)终 止反应。7.1.2.4 探针标记效 率的检测 a)分别从 29 管（标 记探针）和标记阴 性探针对 照中取 1 L 到尼龙 膜；b)固定核酸到 膜上（烤 箱 120，30 min）；c)把尼龙膜转 移到 20 mL 马来酸 缓冲液里 面，摇晃 2 min；d)10 mL 封闭 液孵育 30 min；e)10 mL 一抗孵育 30 min；f)10 mL 洗涤液冲洗 15 min 2 次；g)10 mL 稀释液平衡 2 min5 min，调节 pH=9.5；h)2 mL 底物显色液 黑暗中孵 育；i)50 mL 灭菌双蒸水 冲洗尼龙 膜，终止 反应。7.1.2.5 斑点杂交检 测 a)剪 取适合大 小的尼龙膜 0.7 mm 0.7 mm，划 好格子，做好标记；b)膜上做好标 记，分别 吸取 1.0 L 样品 DNA 点于膜 上格子中 央；c)将硝酸纤维 素膜（NC 膜，点样面朝 上）放于 已用变性 液饱和的 双层滤纸 上变性 10 min；d)再放于已用 中和液饱 和的双层 滤纸上中和 5 min；e)NC 膜室温干燥 30 min，然后在 80 干烤 2 h 固定 DNA；f)将 NC 膜放于预杂交液于 68 反应 2 h，期间经常 摇动 NC 膜；g)将探针于沸 水中变性 10 min，取出 立即置于 冰水浴中 5 min；将变 性的探针 倒入预杂 交 液中，充分混匀即 成杂交液，使 NC 膜在其中 68 杂 交 6 h 以 上（一般 杂交过夜）；将膜 取出 放于直径 11 cm 平皿中，杂交液回 收可反复 使用；h)将 NC 膜放于洗液 中于室 温洗涤 15 min，2 次，期间经 常摇动 NC 膜；洗液中于 68 洗涤15 min，2 次，期间 经常摇动 NC 膜；缓冲 液中洗 1 min；缓 冲液中 反应 30 min，期 间经常摇动 NC 膜；i)在 20 ml 缓冲液 中加入 4 L 抗 Digoxiaenin 抗体（碱性 磷酸酶标 记物，用之前离心 5 min，7826 g，将 膜放于其中 37 浸泡 30 min；洗膜：缓冲液 洗涤；5 min 5 次；j)缓冲液中 反应浸泡 2 min；在 适当大小 的平皿中 加入 10 mL 缓 冲液和 100 L（NBT 和 BCIP混合物），将 NC 膜放 入其中显色 30 min 1 h，注意 显色时应 避光保存；加入 TE 缓 冲液（pH 8.0）终 止显色反 应。DB37/T 3317 2018 5 7.2 结果判定 7.2.1 多重 PCR 结果分析条 件设定 7.2.1.1 以 ALV-A、ALV-J 为阳 性对照，凝胶电泳 上阳性对 照出现特 异性目的 条带为检 测结果成 立 的前提条件，否 则结果不 成立。7.2.1.2 凝胶电泳上 未出现特 异性目的 条带判定 为阴性。7.2.1.3 凝胶电泳上 出现特异 性目的条 带判定为 阳性。7.2.2 斑点杂交结 果 7.2.2.1 以标准模式株 ALV 为 阳性对 照，SPF 鸡肝脏、禽网状内 皮组织增 生症病毒（REV）、马 立 克氏病病毒（MDV）为阴性 对照，阳 性对照出 现斑点和 阴性对照 不出现斑 点为检测 结果成立 的 前提条件，否则结果不成 立。7.2.2.2 点样膜上不 出现斑点 视为阴性。7.2.2.3 尼龙膜上加 样点处 ALV-env 探 针出现清 晰的斑点 为阳性结 果。8 技术评价 8.1 多重 PCR 技术具有高 特异性、高灵敏度、高效率、低成本 的特点,适 合大量样 本的分析 与 鉴定。8.2 斑点杂交检 测技术的 优点是杂 交时一张 膜上可同 时检测多 个样品，操作方便，耗时相 对 较短，并可做半定量 分析；该 方法无需 特殊的仪 器设备，试剂成本 较低，阳 性信号清 晰。8.3 两种技术结 合可鉴别 ALV-A 和 ALV-B 的 感染，同 时可排除 内源性禽 白血病病 毒的干扰，提高ALV-A/B 和 ALV-J 诊断的准 确率。_