ICS 11.22 B 41 备案号：DB42 湖北省 地 方 标 准 DB 42/T 1109 2015 牛流行热 诊断和防 治技术规 范 Technique guideline on diagnosis,treatment and prevention of bovine ephemeral fever（报批稿）2015-10-30 发布 2015-12-20 实施 湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB42/T 1109 2015 I 目 次 前言.II 引言.III 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 诊断.1 3.1 诊断 指标.1 3.2 结果 判定.2 4 综 合防 治.2 4.1 免疫.2 4.2 治疗.3 4.3 疫情 处置.3 4.4 生物 安全 措施.3 附录A（规 范性 附录）牛流行 热病 毒 RT-PCR 检 测 方法.4 DB42/T 1109 2015 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 这些 专利的 责任。本标准 由华 中农 业大 学提 出。本标准 由华 中农 业大 学归 口管理。本标准 起草 单位：华 中农 业大学。本标准 协作 起草 单位：随 州市弘 大畜 牧有 限责 任公 司、湖 北省 松滋 市春 珍肉 牛养殖 场。本标准 起草 人：郭爱 珍、晁金、邓明 亮、彭清 洁、胡长敏、陈 颖钰、曹 永强、周春、陈 焕春。DB42/T 1109 2015 III 引 言 牛流行 热（Bovine ephemeral fever,BEF），又 称 牛暂时 热、三 日热，是由 牛流行 热病毒 引起 的一种急 性、热性、蚊 媒传 播 性传 染病，其 特征 为：发病 突 然，迅速 波及 全群，病牛 高热，呼吸急促，流透明或 带泡 沫状 涎水，流 泪，运 动障 碍，妊娠 牛 可 发生 流 产。该病在 炎热、多 雨、蚊蠓滋 生季 节流 行，是危 害湖 北省养 牛业 的重 要疫 病。由于发 病急、传 播 快，治疗难 度大。为 有效 预防 和控制 牛流 行热，特 制定 本技术 规范，供 湖北 省养 殖企业 和养 殖户 参照使用。DB42/T 1109 2015 1 牛 流行热 诊断和防 治技术 规范 1 范围 本规范 规定 了牛 流行 热疫 情 的诊 断 和 综合 防治 技术。本规范 适用 于 湖 北省 牛养 殖企业 和养 殖户 对 牛 流行 热 的诊 断和 防治。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是标 注日期 的引 用文 件，仅所 注日期 的版 本适 用 于 本文件。凡是 不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用于 本文件。GB 16548 病害 动物 和病 害 动物产 品生 物安 全处 理规 程 3 诊断 3.1 诊断指 标 3.1.1 流行病 学调 查 对发病 场进 行流 行病 学调 查，根 据发 病地 区、发 病 对象、发病 季节、传播 方 式、主 要症 状等，进行初步诊 断。该病 流行 病学 特点主 要如 下：a)主要侵 害牛，黄 牛、奶牛、水牛 均可 感染 发 病，奶 牛、黄 牛易 感性 最大，水牛 易感 性较 低；b)以3 岁5 岁壮 年牛 发病 最多，犊牛 和老 龄牛 发病 少；c)传染源 主要 为临 床发 病牛，发热 期病 牛血 液、呼吸 道分泌 物及 粪便 中都 带有 病毒；d)蚊、蝇、蠓 等吸 血昆 虫 经 叮咬传 播该 病；e)呈明显 季节 性，多发 于雨 量多和 气候 炎热 的 6 月 9 月；f)传播迅 速。3.1.2 临床观 察 对发病 牛进 行临 床症 状观 察，获 得进 一步 的诊 断依 据。该 病的 临床 症状 特点 主要如 下：a)潜伏期 为3 天7 天，发 病突然，迅速 传播 至全 群；b)体温升 高 到40 以 上，稽 留2 天3 天，之后 恢复 正常；c)显著流 涎，口角 有泡 沫；d)鼻镜干 而热，流 鼻液；e)流泪，有水 样眼 屎，眼睑 肿胀，结膜 充血；f)呼吸促 迫，呼 吸 次数 可 达80 次/分以 上，甚至 因窒 息死亡；g)病牛呆 立，步态 僵硬(故名 僵直 病)，跛 行，严重者 后肢麻 痹、站立 困难、瘫痪；h)食欲废 绝，反刍 停止；i)妊娠母 牛可 发生 流产、死 胎；j)泌乳量 下降 或泌 乳停 止。DB42/T 1109 2015 2 3.1.3 病理剖 检 对病死 牛进 行病 理剖 检，重点观 察呼 吸系 统病 变，对临床 初步 诊断 进行 验证。主要 病理 变 化 如 下：a）肺气肿 明显，有 时伴 有肺 水肿和 充血，气 管积 有多 量泡沫 状黏 液；b）真胃、小肠 和盲 肠 可 见黏 液增多、出血、黏膜 脱落 等变化；c）肝、脾、肾 轻度 肿胀，有 局灶性 坏死 病变。3.1.4 病原学 诊断 病原学 诊断 是确 诊该 病的 关键依据，主要 有核 酸检 测和病 毒分 离鉴 定。3.1.4.1 临床样 本 的RT-PCR 检测 a)模 板提 取：取病 牛发 热期肝 素钠 抗凝 血，反复 冻融3 次，用病 毒RNA 提取 试剂盒 提取RNA。b)RT-PCR：针对 牛流 行 热病毒G 基因 计设引 物，进 行RT-PCR 扩 增，扩 增产 物 送商业 公司测 序和 分析。操 作方 法见 附录A。3.1.4.2 病毒分 离鉴定 a)细 胞培 养：取病 牛发 热期 肝 素钠 抗凝 血5 mL 10 mL,反复 冻融3 次后，4 离心（1000 g）5 min后取上 清，接 种于 在DMEM 培养基 中（含10%胎牛 血清）长 成单 层的 乳仓 鼠肾 细 胞或非 细胞 或绿 猴肾 细胞，让上清 液 铺 满细 胞单 层，37 吸 附1h（其 间轻 轻振 荡 数次），加 入含2%胎 牛血 清的DMEM 细 胞维 持液 中，置37 培养2 天3 天，连 续观察 是否出 现细 胞病变。若出 现病变，则 待细胞 出现80%细胞 病变 时终 止 培养，将 培养物 冻融3 次后，经无菌 检验合 格后，小管 分装（1 mL/管），-70 冻存备 用，进 行RT-PCR 检测确诊；若 未发 生细 胞病 变，盲 传3 代，至出 现细 胞 病变；若盲 传3 代后 仍未 出 现细胞 病变,且用3.1.4.1方法（RT-PCR）鉴 定为 阴 性者，视为阴 性；若盲传3 代后仍 未出现 细胞 病变但RT-PCR 鉴定为 阳性 者视为阳性，继续 传代，直 至出 现细胞 病变。b)动 物接 种试 验：取病 牛发 热 初期 肝素 钠抗 凝血液5 mL 10 mL，分 离白 细 胞，取30 L 对出生1日龄内 乳鼠 或乳 仓鼠 脑内 接种（接种1 代），每日 观 察2次，一般5天6天 发病，不久 死亡。取死 鼠脑 制备乳剂（用 生理 盐水 冲洗3-4次脑 组织，然 后研 磨，用4层 纱布 对研 磨液 进行 过 滤，滤 液即 为乳 剂），按以上方 法接 种乳 鼠（接种2 代），连 续3 次传 代后，可100%致 死接 种乳 鼠，然 后 取 脑组织 乳剂 进行3.1.4.1描述的RT-PCR 检 测，进行 确诊。3.2 结果判 定 对上述 检测 结果 进行 如下 判断：a)疑 似牛 流行 热病 例：符合该 病的 流行 病学 调查（参见3.1.1）和临 床 观 察（参见3.1.2）或病理剖检（参见3.1.3）之一，即可定 为疑 似牛 流行 热病 例。b)确 诊牛 流行 热病 例：疑似牛 流行 热病 例，病原 学诊断（参 见3.1.4.1 和3.1.4.2）任 何一 项阳 性，均可确 诊 为 牛流 行热。4 综合防 治 4.1 免疫 每年在 蚊蝇 蠓 滋生 季节到 来前1.5 月2 月，给牛接 种牛流 行热疫 苗，间隔3 周 再以同 样剂量 加强 免疫1次，接 种途 径和 剂量 参 照产品 说明 书。免疫 保护 期6个 月。DB42/T 1109 2015 3 4.2 治疗 主要进 行对 症治 疗，包括 退热、缓解 呼吸 困难、强 心、消 炎镇 痛、抗菌 措施。4.3 疫情处 置 任 何人 如发 现 疑 似疫 情，应及时 向企 业主 管 领 导和 当地兽医 部门 报告，并 采 取隔离、消毒 等生 物安全措施 防止 疫情 扩散。同 时，采 样送 相关 实验 室 进 行病原 学检 测 确 诊。4.4 生物安 全措 施 4.4.1 消毒 a)杀 灭传 播媒 介：取2.5%溴氰 菊酯（敌王）乳 剂，按产品 使用 说明 书稀释，喷洒牛 舍、运动 场 和排粪沟 等环 境设 施，每周 两次，杀灭 蚊、蝇、蠓等 节肢动 物。b)环 境设 施消 毒：用商 业化消 毒剂（二 氧化 氯、过氧乙 酸、甲醛 等），按 产品使 用说 明书 规定 浓度，对 牛舍 地面、食槽、车辆、对发 病或 病死 动物 的排泄 物和 污染 物进 行消 毒，以 杀灭 病毒，减 少 传 染源。c)人员 出入 消 毒：对于 进、出 场的 人员，进 行 消 毒。d)车辆、工具 出入 消毒：用商 业化 消毒 剂（二氧 化氯、过氧 乙酸、甲 醛等），对 出入 车辆、工 具进行消 毒。4.4.2 无害化 处理 病死牛、污 染的 垫料 和饲 草等，按GB 16548 进 行无 害化处 理。4.4.3 产品处 理 a)发 病动 物禁 止急 宰销 售。b)治 疗期 间的 牛奶 和牛 肉等牛 产品，禁 止上 市销 售。c)对 于治 疗痊 愈牛 生产 的牛奶 和牛 肉等 牛产 品，其上市 须符 合国 家对 有关 药物的 休药 期规 定。DB42/T 1109 2015 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）牛流行 热病 毒 RT-PCR 检 测 方法 A.1 引物设 计与 合成 根据牛 流行 热病 毒（Bovine ephemeral fever，BEFV）主要 免疫 保护 性糖 蛋白 G（BEFV-G）的 保守核苷酸 序列（GenBank登录号AF058321）设 计引 物，序列为：BEFV F（5 ATTTACAATGTTCCGGTGAA3）（nt 19 38）BEFV R（5 GGTATCCATGTTCCGGTTAT3）（nt 523 542）引物由 商业 公司 合成。扩 增片段 大小 为523bp。A.2 方法 A.2.1 RNA的 提取 与 反 转录 合成cDNA 采集高 热期病 牛全 血5 mL 10 mL，肝 素钠抗 凝。采 用病毒RNA 提 取试剂 盒（TIANGEN）提取 血液 的总RNA。用反转 录试剂 盒（Takara,Japan）进行反 转 录（reverse transcription,RT）成cDNA。体系为：5 gDNA Eraser buffer 2 L，gDNA Eraser 2 L，RNA 7 L；室 温放 置5min；然 后加primeScript RT Enzyme mix 1 L，RT primer mix 1 L，5primeScript buffer 21 L，Rnase free H2O 4 L，总体积20 L，混合 均匀。反 应条 件：37 15 min，85 5 s，4 5 min。A.2.2 PCR PCR 反 应体 系为：cDNA 2 L，LA taq 聚 合酶0.25 L，10LA buffer 2.5 L，dNTP mixture 2 L，上下游 引物（F、R）各0.5 l，加至H2O 25 L。PCR 反应条 件为：95 预变 性4min；95 变性1 min，50 退火45 s，72 延 伸53 s，35个 循环；72 延伸10 min，16 20 min。PCR产物4 保存。A.3 结果判断 将RT-PCR产 物在1%琼脂 糖 凝胶 上 进行 电 泳检 测，预 期 产物 大小为523bp，在 凝 集染色 后出现 特异 性目的条 带。序列 测定 后，将获得 的产 物序 列与GenBank（GenBank 登 录号AF058321）发 表序 列比 对，相似性在99%以 上时，确 定为 牛 流行热 病毒。_