ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1610 2019 黄花矶松 组织培养 技术规程 Technical regulation of tissue culture of limonium aureum 2019-03-15 发布 2019-06-15 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 1610 2019 I 目 次 前言.1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 实 验室 要求 与设 施.1 4 培 养基 的制 备.1 5 组 织培 养过 程.2 附录A（资 料性 附录）B5 基础 培养 基成 分.4 DB15/T 1610 2019 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由内 蒙古 蒙草 生态 环境（集团）股 份有 限公 司提出。本标准 由内 蒙古 自治 区草 原生态 修复 标准 化技 术委 员会(SAM/TC34)归口。本标准 起草 单位：内 蒙古 蒙草生 态环 境（集团）股 份有限 公司。本标准 主要 起草 人：高秀 梅、田 志来、马 怀林、张 永清、李晶 晶、白俊 梅、崔海鹏、刘 思泱。DB15/T 1610 2019 1 黄花矶松 组织培 养技术规 程 1 范围 本标准 规定 了黄 花矶 松组 织培养 中的 实验 室要 求与 设施、培养 基的 制备 和组 织培养 过程。本标准 适用 于内 蒙古 地区 黄花矶 松组 培苗 的规 模化 育苗生 产。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 603 化学 试剂 试 验 方法中 所用 制剂 及制 品的 制备 NY/T 2306-2013 花 卉种 苗组培 快繁 技术 规程 3 实验室 要求 与设 施 实验室 设计 与设 施按 照 NY/T 2036-2013，4.1.3 执 行。4 培养基 的制 备 4.1 培养基 的配 制 B5 培 养基 母液 的配 制顺 序 参见附 录 A，配 制使 用蒸 馏 水。大 量元 素按 照比 使用 浓度 高 10 100 倍进行配制，微 量元 素按 照比 使用浓 度 高20 1000 倍 进 行配制，作 为贮 备液。4.2 植物生 长调 节剂 母液 的配 制 4.2.1 配制 植物生 长调 节剂 母液 的配 制浓度 为 KT 0.2 mg/L 0.8 mg/L、NAA 0.05 mg/L 0.1 mg/L、2,4-D 0.02 mg/L0.08 mg/L、IBA 0.1 mg/L。4.2.2 保存 配制好 的母 液贴 上标 签，注明名 称和 日期，保 存于 约 4 冰 箱中，尽 快使 用。4.2.3 其他物 质 用3 g/L 5 g/L 卡 拉胶 作 固化剂，25 g/L 35 g/L 的食用 白糖 代替 蔗糖 作为 碳源。DB15/T 1610 2019 2 4.3 培养基 的制 作 4.3.1 母液配 制 烧杯中 加入3 g/L 5 g/L 卡拉胶，25 g/L 35 g/L 的食用 白糖，按照附 录A依 次取大 量元素、微 量元素、铁盐、有 机成 分，根据生 长要 求加 入植 物生 长调节 剂（不耐 高温 的药 品，应 在培 养基 灭菌 后 再 过滤灭菌 加入），贴上 标签，注明 名称 和日 期，保存 于4 冰箱 中，尽快 使用。4.3.2 定容 取出母 液，用 玻璃 棒搅 拌 混匀，加 入沸 腾的 自来 水 并不断 搅拌 使卡 拉胶 和糖 溶解，加 水至 容器 刻度（1 L 或10 L）。4.3.3 pH 调试 定容后 用0.1 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液，调 节pH 为 5.8 6.0。配 置溶 液方 法按 照 GB/T 603 执行。4.3.4 分装 将调节 好的 培养 基根 据不 同需求 进行 分装，诱 导培 养基规 格为 容 量300 ml 的 培养瓶，每 瓶分 装40 ml 50 ml；增 殖培 养基 规 格为容 量 300 ml 的培 养 瓶，每 瓶分 装 40 ml 50 ml；生 根培 养基，每 瓶分装 30 ml 40 ml。4.3.5 封口 分装好 的培 养瓶 用封 口膜 或者瓶 盖进 行封 口，并用 绳子扎 紧或 拧紧。4.3.6 灭菌 将封口 后的 培养 瓶 在121 中灭 菌20 min 25 min。4.3.7 存储 灭菌后 的培养 基应 标明编 号及日 期，冷 却和 凝固后 放置观 察 2d 3d，按灭 菌 先后顺 序使用，且 存储时间 不超 出一 个月。5 组织培 养过 程 5.1 外植体 的选 取及 灭菌 5.1.1 外植体 选取 5.1.2 外植体 灭菌 外植体 灭菌 流程 为：a)用流水 冲 洗30 min 40 min；b)转入超 净工 作台，吸 水纸 吸去水 分后 在 70%75%酒精中 处 理 1 min 2 min，再 用 0.1%的升汞溶 液处 理8 min 10 min；c)无菌水 淋 洗67 次，用 已 灭菌的 滤纸 吸干，接 种在 备好的 培养 基中。DB15/T 1610 2019 3 5.2 培养条 件 培养温 度 为25 2；光照 强度 为1500 Lx 2000Lx；光 照时 间为12 h/d 16 h/d。5.3 初代培 养 将外植 体接 种 到B5+KT 0.2 mg/L 0.8 mg/L+NAA 0.05 mg/L 0.1 mg/L+2,4-D 0.02 mg/L 0.08 mg/L 初 代 诱导 培养 基上，培养 15 d 后产 生愈 伤组 织，20 d 左 右可 产生 结构 紧 密，淡 绿色 的不 定芽。5.4 继代培 养 将诱导 出的 不定 芽取 出，接种 于 B5+KT 0.5mg/L 0.8 mg/L+NAA 0.05 mg/L 0.1 mg/L 继代 增 殖培养基 上，30 d 后 基础 苗 分裂的 成熟细 胞转 变为具 有分裂 能力的 细胞 生长出 健壮、茂密、叶色 正绿带有 2 片 叶子 的无 根小 苗。需要大 量生 产时，可 重复 此过程。5.5 生根培 养 将继代 培养 中带 有叶 尖的 不定芽，分 成单 株转 入培 养基 B5 IBA 0.1mg/L 中 进行生 根培 养，附加 食用白砂 糖25 g/L 35 g/L，卡拉 胶3 g/L 5 g/L，7d 后约85%的基 础苗 生根，根系 发达，生 长势 表现良好。5.6 炼苗 当根长 约1 cm，且具 有两 条以上 根系 时，将组 培苗 移入温 度 为 20 25，湿度 为 80%的 环境中炼 苗16 d。闭瓶 苗移 到 光照 为 2000 Lx 的自 然光 下照 射 6 d，再 除去 封口 材料炼 苗 10 d。5.7 移栽 炼苗后 洗净 根部 残留 的培 养基，移入 栽培 基质 中，基质配 比为 蛭石+珍 珠岩（3:2），缓 苗期 间控 制适宜温 湿度，勿 积水。DB15/T 1610 2019 4 A A 附 录 A（资料 性附 录）B5 基 础培 养基 成分 表A.1 B5 基 础培 养基 成分 成分 使用浓度 mg/L 大量元素(NH4)2SO4 KNO3 CaCl 2H2O MgSO4 7H2O NaH2PO4 134 2500 150 250 150 微量元素 KI H3BO3 MnSO4 4H2O ZnSO4 7H2O Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6H2O 0.75 3.0 10 2.0 0.25 0.025 0.025 铁盐 FeSO4 7H2O Na2 EDTA 2H2O 27.8 37.3 有机成分 肌醇 烟酸 盐酸吡哆醇 烟酸硫胺 谷氨酰胺 100 1.0 1.0 10 800 _