ICS 65.020.30 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 18282014 牦牛源沙门氏菌 PCR检测技术规范 2014-09-19发布 2014-10-01实施四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 18282014 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 设备和试剂.1 5 DNA提取.2 6 PCR扩增.3 7 PCR 产物的电泳检测.3 8 结果判定.3 9 废弃物处理.3 附录 A（规范性附录）相关试剂配制.4 DB51/T 18282014 II 前 言 本标准附录A为规范性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：西南民族大学。本标准主要起草人：张焕容、汤承、岳华、杨发龙、王永、张斌、任玉鹏、王远微。DB51/T 18282014 1 牦牛源沙门氏菌 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了牦牛源沙门氏菌的PCR检测方法。本标准适用于牦牛源沙门氏菌的检测与鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。兽医实验室生物安全技术管理规范（2003农业部公告第302号）。3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。3.1 沙门氏菌属 salmonella 是一群寄生于人和动物肠道内的革兰阴性杆菌，生化特性和抗原结构相似，兼性厌氧。绝大多数发酵葡萄糖产酸产气，也偶尔有不产气的。在三糖铁琼脂上常产生 H2S。3.2 牦牛源沙门氏菌 salmonella in Yak 是指从牦牛实质器官、粪便和肉品中分离鉴定的沙门氏菌，包括致病性和非致病性沙门氏菌。致病性沙门氏菌常引起犊牦牛副伤寒，犊牦牛或青年牦牛急性胃肠炎和败血症及其他组织局部炎症。且为人类食物中毒的主要病原之一。4 设备和试剂 4.1 主要仪器和设备 4.1.1 PCR 扩增仪 4.1.2 电泳仪、水平电泳槽 4.1.3 凝胶成像系统 4.1.4 冷冻高速离心机 4.1.5 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作）4.1.6 高压灭菌锅 DB51/T 18282014 2 4.1.7 恒温水浴锅 4.1.8 移液器（0.1 L10 L、2 L20 L、20 L200 L、200 L1000 L）4.2 主要试剂 4.2.1 引物（10 mol/L）上游引物：5-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3；下游引物：5-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3。引物扩增片段大小为 284 bp。4.2.2 DNA 提取试剂：蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠（SDS）、Tris 饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。4.2.3 PCR 反应试剂：Taq DNA 聚合酶（5 U/L）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（每种浓度为 2.5 mmol/L）、10PCR Buffer(无Mg2+)。4.2.4 STE 缓冲液（见附录 A）4.2.5 TAE 电泳缓冲液（见附录 A）4.2.6 6上样缓冲液（6Loading Buffer）4.2.7 琼脂糖（电泳级）4.2.8 核酸染料(Goldview)4.2.9 DNA 分子量标准 DL600 4.2.10 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水（三蒸水）规格。4.2.11 阳性对照：标准参考菌株作为阳性对照。4.2.12 阴性对照：用 GB/T 6682 中三级水代替 PCR 扩增模板作为阴性对照。5 DNA 提取 5.1 样本处理 5.1.1 粪便样本：无菌取约 1 g 粪便接种至 10 mL 缓冲蛋白胨水（BPW）增菌液，37培养 24 h。取1mL BPW 增菌液分别接种于 10 mL 四硫磺酸钠亮绿（TTB）增菌液，42培养 24 h。1 mL 增菌液 12000 r/min 离心20 min,弃上清，收集沉淀用于 DNA提取。5.1.2 组织样本：按 1g 加入 1mL 的STE 缓冲液进行研磨，3000 r/min 进行离心10 min，取上清液，12000 r/min进行离心 20 min，弃上清，沉淀用于 DNA 提取。5.1.3 固体培养物：用接种环取固体培养基上的菌落用于 DNA 提取。5.1.4 液体培养物：12000 r/min 离心 20 min,弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。5.1.5 对照样本 DNA 提取与检测样本处理方法相同。5.2 DNA提取方法 5.2.1 上述沉淀中加入 500 L STE 缓冲液，使其重悬。5.2.2 加入 10%SDS 溶液20 L，20 mg/mL 蛋白酶 K10 L，混匀，在 56水浴60 min。5.2.3 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀，12000 r/min 离心 5 min。5.2.4 转移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 r/min 离心5 min。5.2.5 取上清，加入 2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20沉淀 30 min，12000 r/min 离心5 min，弃去上清液。5.2.6 用 1 mL 70%乙醇漂洗，12000 r/min离心 5 min，重复 2-3 次。DB51/T 18282014 3 5.2.7 室温干燥，DNA 沉淀用 25 L 无菌三蒸水溶解作为模板，-20保存备用。6 PCR 扩增 6.1 每次进行 PCR 扩增时，除检测样品外，均需设置阳性和阴性对照。6.2 PCR 反应体系：10 PCR Buffer 2.0 L，10 mmol/L dNTPs 2.5 L，Taq 酶0.5 L，模板DNA（空白对照用水代替）1 L，上游引物1 L，下游引物 1 L，水17 L，总体积 25 L。6.3 PCR 反应条件：94预变性5 min；94 变性45 s；60 退火45 s；72 延伸10 min，依次进行 30 个循环。7 PCR产物的电泳检测 7.1 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。7.2 取5 L PCR产物与 1 L 6上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入 DNA 分子量标准（DL600），以5 V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。8 结果判定 8.1 阳性对照出现一条 284bp 大小的条带，且阴性对照不出现条带。8.2 在满足 8.1的条件下，被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条 284bp 的条带判定为核酸阳性（+）；被检样品的 PCR 产物经电泳后不出现 284bp 的条带判定为核酸阴性（-）。9 废弃物处理 按GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理。废弃物实行无害化处理。DB51/T 18282014 4 A A 附 录 A（规范性附录）相关试剂配制 A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠（含12 个结晶水）9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1 0 00 m L pH 7.20.2 A.1.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 15min。A.2 STE缓冲液 0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0)1 mmol/L EDTA(pH8.0)A.3 TAE电泳缓冲液（pH8.0）50TAE 电泳缓冲液贮存液：Tris 碱 242 g EDTA 37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 加双蒸水至 1000 mL，应用前用双蒸水将 50TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。A.4 2%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 2 g 1TAE电泳缓冲液 100 mL 将琼脂糖放入TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60 左右时加入5 L的核酸染料，混匀，均匀倒板，厚度为3mm-5mm。_ DB51/T 18282014