ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2078 2014 鹿源结核杆菌基因分型 MLVA法 MLVA Method for Genotyping of Mycobacterium Tuberculosis from Deer 2014-05-04发布 2014-06-01实施 吉林省技术质量监督局 发布 DB22/T 2078 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林农业大学、吉林省中韩动物科学研 究院。本标准主要起草人：王春雨、杨莉、李忠平、石建平、王全凯、孙磊、宋立品、孔德鑫。DB22/T 2078 2014 1 鹿源结核杆菌基因分型 MLVA法 1 范围 本标准规定了鹿源结核杆菌 MLVA分型方法。本标准适用于鹿源结核杆菌 MLVA基因分型。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必 不可少 的。不注日期 的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分 析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB 19489 实 验 室生 物 安 全 通 用要 求 SN/T 2025 动物检疫 实 验 室生 物 安 全 操作 规 范 3 缩略语 下列 缩略语 适用于本文件。3.1 MLVA:多 位 点可变数目串联重复序 列分 析 3.2 DNA marker：脱氧 核 糖 核 酸 分 子 标 记 3.3 SDS:十二烷 基 硫酸钠 3.4 PCR:聚合酶链式反 应 3.5 Tris-HCl:三羟甲 基 氨 基 甲烷盐酸缓冲液 3.6 EDTA：乙二胺四乙酸 4 生物安全要求 操作过程 的 生 物 安 全 措施 应 遵守 GB 19489和 SN/T 2025的 有关 规定。5 原理 多 位 点数目可变串联重复序 列分型(multiple locus VNTRs analysis，MLVA)以 PCR扩增为 基 础，利 用 PCR方法 扩增散在 于菌 株 基因 组 中的 不同独 立位 点可变数目串联重复序 列(VNTR)，对 扩增产 物 进行 DNA分 析 确 定 长度，根据 不同 位 点重复序 列单 拷贝长度计算 出 拷贝 数，由 不同 位 点 拷贝 数组 成 菌 株 基因型。6 材料与试剂 6.1 实 验用 水：本 实 验用 水为 符 合 GB/T 6682要 求 双蒸 水。6.2 50 bp DNA marker DB22/T 2078 2014 2 6.3 10%SDS：10 g的 SDS粉末溶解 于 70 ml双蒸 水 中，定 容到 100 ml。6.4 PCR扩增 预混 液 6.5 1 M Tris-HCl(pH 8.0):称取 Tris碱 6.06 g，加双蒸 水 40 ml溶解，滴加浓 HCl调 pH至 8.0，定 容至 50 ml。6.6 0.5 M EDTA(pH 8.0):称取 EDTA-Na2 2H2O 9.306 g，加双蒸 水 35 ml，搅拌，用 NaOH调 pH至8.0，定 容至 50 ml。6.7 苯酚/三 氯 甲烷/异戊醇（体积比 25；24；1）6.8 三 氯 甲烷 6.9 CTAB裂解 液：2 CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.02 mmol/L Na2-EDTA(pH 8.0)。6.10 CTAB沉淀 液：0.5 CTAB，0.04 mmol/L NaCl。6.11 TE缓冲液:称取 1 M Tris-HCl(pH 8.0)1 ml和 0.5 M EDTA(pH 8.0)0.2 ml，加加双蒸 水 定 容至 100 ml。6.12 PCR引 物 本规 程 选择 13个 MLVA位 点作为扩增 位 点，各 位 点引 物 见表 1，引 物 保存 于-20，临 用 前取 出用 双蒸 水 稀释 为 10 pmol/l，置-20 保存。表 1 MLVA位点扩增引物 位 点 名称 引 物 名称 序 列(5to3)碱 基 数 QUB-11ba CGTAAGGGGGATGCGGGAAATAGG 24 QUB-11b QUB-11bb CGAAGTGAATGGTGGCAT 18 MIRU 4a GCGCGAGAGCCCGAACTGC 19 MIRU 4 MIRU 4b GCGCAGCAGAAACGCCAGC 19 MIRU 40a GGGTTGCTGGATGACAACGTGT 22 MIRU 40 MIRU 40b GGGTGATCTCGGCGAAATCAGATA 24 MIRU 31a ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA 24 MIRU 31 MIRU 31b GTGCCGACGTGGTCTTGAT 19 Mtub4a CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT 25 Mtub4 Mtub4b GGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC 23 ETR Aa AAATCGGTCCCATCACCTTCTTAT 24 ETR A ETR Ab CGAAGCCTGGGGTGCCCGCGATTT 24 Mtub30a CTTGAAGCCCCGGTCTCATCTGT 23 Mtub30 Mtub30b ACTTGAACCCCCACGCCCATTAGTA 25 Mtub21a AGATCCCAGTTGTCGTCGTC 20 Mtub21 Mtub21b CAACATCGCCTGGTTCTGTA 20 QUB-26a AACGCTCAGCTGTCGGAT 18 QUB-26 QUB-26b CGGCCGTGCCGGCCAGGTCCTTCCCGAT 28 MIRU 23a CTGTCGATGGCCGCAACAAAACG 23 MIRU 23 MIRU 23b AGCTCAACGGGTTCGCCCTTTTGTC 25 MIRU 39a CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC 24 MIRU 39 MIRU 39b CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT 24 Mtub34a GGTGCGCACCTGCTCCAGATAA 22 Mtub34 Mtub34b GGCTCTCATTGCTGGAGGGTTGTAC 25 MIRU 2 MIRU 2a TGGACTTGCAGCAATGGACCAACT 24 DB22/T 2078 2014 3 MIRU 2b TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT 22 7 仪器与设备 7.1 生 物 安 全 柜 7.2 梯度 PCR仪 7.3 毛细管电泳 分 析 系统 7.4 高速冷冻离心机：最 高离心力 可 达 15000 g以 上 7.5 高压灭 菌 器 7.6 涡漩振荡器 7.7 移 液 器 8 操作步骤 8.1 DNA提取 8.1.1 将 结核杆菌 置高压灭 菌 器 中 121 下 15 min 灭活，取 2-3个 菌 落或 50 l菌 液 放 入 离心管 中，加 入 200 l TE缓冲液，加 10%SDS至终浓度 为 1%，置 85 90 水 浴 10 min。8.1.2 加 入 1.0 mL CTAB裂解 液 及 50 L 蛋白 酶 K溶 液，涡 旋震 荡 30 s后，颠倒 混 合 5 次，65 水 浴 过 夜（12h-16h）。8.1.3 室 温 12 000 r/min离心 10 min，取上 层 溶 液 800 L，加 入 等 体积 的 Tris饱 和 酚/三 氯 甲烷/异戊醇（25:24:1，v/v/v），轻轻颠倒 离心管混 匀，室 温 12 000 r/min离心 10 min；取上 层清 液(水 相)于 一 新 离心管 中，加 入 等 体积 的 三 氯 甲烷/异戊醇（24:1，v/v），颠倒 混 匀，室 温 12 000 r/min离心 10 min，取上 清 液 600 L，加 入 2倍 体积 的 CTAB沉淀 液，混 匀，室 温静 置 60 min。12 000 r/min离心 15 min，弃 上 清 液。加 入 500 L氯 化 钠 溶 液 溶解沉淀，然后 加 入 500 L三 氯 甲烷，振荡混 匀，12 000 r/min离心 10 min，将上 清 液 移至 一 新 离心管，加 入 0.6倍 体积 的 异 丙 醇，混 匀，4 静 置 30 min，4，12 000 r/min离心 10 min，小 心 弃去 上 清 液，向 沉淀加 入 500 L 70%冷 乙 醇，洗涤 沉淀，4，12 000 r/min离心 5 min，小 心 倒 出 上 清 液，室 温干燥后，将 DNA溶 于 50 L去 离 子水 中，-20 保存。也 可 使 用 等效 的 商 品 化 试 剂盒 提 取 模板 DNA。8.2 DNA浓度和纯度的测定 取 5 L DNA溶 液 加 二 次 蒸 馏 水 稀释至 1 mL，使 用核 酸 蛋白 分 析 仪或 紫外 分 光光 度计 分 别 检 测 260 nm和 280 nm处 的 吸光值 A260和 A280。DNA的 浓度 按 式（1）计算：100050=N Ac.(1)式 中：c DNA浓度，单位 为 微克每微升（g/L）；A 260 nm处 的 吸光值；N 核 酸 稀释 倍 数。8.3 PCR反应体系 DB22/T 2078 2014 4 PCR反 应 体系确 定 为：DNA 0.5 l、上 下 游 引 物(10 pmol/L)各 0.2 l、PCR扩增 预混 液 10 l、双蒸 水 9.1 l。8.4 PCR 扩增 不同 位 点 PCR扩增 条 件 详 见表 2。表 2 不同 MLVA位点 PCR扩增反应条件 位 点 反 应 条 件 第 二 步循环 数 MIRU4 MIRU 23 MIRU31 MIRU 39 MIRU40 MIRU 2 40 第一步 95 15 min 第 二 步 94 1 min，59 1 min 72 1 min30 s 第 三 步 72 10 min ETR A QUB-11b QUB-26 40 第一步 95 12 min 第 二 步 94 30 s 60 1 min 72 2 min 第 三 步 72 7 min Mtub34 Mtub30 Mtub21 Mtub4 40 第一步 95 15 min 第 二 步 94 1 min 50 1 min 72 30 s 第 三 步 72 10 min 8.5 PCR产物毛细管电泳检测 以 50 bp DNA marker为 标准，各 位 点 的 PCR产 物 经 毛细管电泳 检 测，确 定 PCR产 物 片段 大 小，毛细管 电泳 条 件 如 下：加 样 体积：5 l；电压：100 240 V，50/60 Hz；工 作 温 度：10 30；工 作 湿 度：10%75%；运 行程序：使 用 系统 软 件 自带 程序，检 测时间 450 S，进 样时间 10 S。8.6 MLVA位点重复拷贝数 确 定 用 毛细管电泳 检 测 的 PCR产 物 长度 减去 对应 上 下 游 引 物的 长度，再除 以 对应位 点 的单 拷贝 片段 长度，所 得 结 果即 为重复 区 序 列的 拷贝 数。各 重复 区 单 拷贝 片段 长度 大 小 见表 3。表 3 MLVA各 位点重复 序列单 拷贝 长 度 位 点 单 拷贝长度 位 点 单 拷贝长度 MIRU 4 77 Mtub4 51 MIRU 31 53 Mtub21 57 MIRU 39 53 Mtub30 58 MIRU 40 54 Mtub34 54 MIRU 23 53 QUB-11b 69 DB22/T 2078 2014 5 MIRU 2 53 QUB-26 111 ETR A 75 9 结 果 分 析 将 PCR产 物 长度 换 算 为重复序 列 拷贝 数 后，将 换 算 得 到 的位 点重复 拷贝 数 按 MIRU 4、MIRU 31、MIRU 39、MIRU 40、MIRU 23、MIRU 2、ETR A、Mtub4、Mtub21、Mtub30、Mtub34、QUB-11b、QUB-26顺 序 排列，所 得 的 数 据 即 为 鹿源结核杆菌 MLVA基因型。_