ICS 65.020.01 B 30 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1622 2019 白灵菇菌 种生产技 术规程 Regulation of Strain Manufacture for Pleurotus nebrodensis 2019-04-10 发布 2019-07-10 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 1622 2019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 术 语和 定义.1 3 生 产要 求.2 4 母 种生 产.3 5 原 种、栽培 种生 产.5 6 入库.8 7 留样.8 DB15/T 1622 2019 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 编写。本标准 由内 蒙古 自治 区农 牧业科 学院 提出。本标准 由内 蒙古 自治 区农 业标准 化技 术委 员会（SAM/TC 20）归 口。本标准 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院、食 用菌内 蒙古 自治 区工 程研 究中心。本标准 主要 起草 人：孙 国 琴、庞杰、王 海燕、于传 宗、解 亚杰、宋 秀敏、潘永 圣、高 天云、李 亚娇、郭俊波、云 利俊、成 建宏。DB15/T 1622 2019 1 白灵菇菌 种生产 技术规程 1 范围 本标准规 定了 白灵菇（Pleurotus nebrodensis）母 种、原种 和栽 培种生 产有 关的定义、制 作技术流程要 点等。本标准 适用 于工 厂 化 生产 企业 和 合作 社生 产白 灵菇 母种、原种 和栽 培种。2 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 白灵菇 Pleurotus nebrodensis 白灵菇（Pleurotus nebrodensis）又 称翅 鲍菇、百灵 芝 菇、克什 米尔 神菇、阿魏 蘑、阿威 侧耳、阿魏菇、雪 山灵 芝、鲍鱼 菇等。隶属 于侧 耳属。是 一种 食用和 药用 价值 都很 高的 珍稀食 药用 木腐 真菌，通 体洁白、肉质 细腻、味 道鲜 美。2.2 菌种 spawn 菌丝体 生长 在适 宜基 质上 具结实 性的 菌丝 培养 物。分为母 种（一级 种）、原 种（二 级种）和 栽 培种（三级 种）三级。2.3 母种 stock culture 经组织 分离、孢 子分 离等 方式获 得到 的具 有结 实性 的菌丝 体纯 培养 物及 其继 代培养 物，以玻 璃试 管或培养 皿为 培养 容器 和使 用单位，也 称为 一级 种、试管种。2.4 原种 pre-culture spawn 由母种 移植、扩 大培 养而 成的菌 丝体 纯培 养物，也 称为二 级种。2.5 栽培种 spawn 由原种 移植、扩大 培养 而 成的菌 丝体 纯培 养物，也 称为三 级种。栽培 种只 能 用于扩 大到 栽培 出菇 袋或 直接 出菇，不 可以 再次 扩大繁 殖菌 种。DB15/T 1622 2019 2 2.6 固体菌 种 solid spawn 以富含 木质 素、纤维 素和 半纤维 素或 淀粉 含量 高的 谷物粒 等天 然 有 机物 为主 要原料，添 加适 量的 有机氮源 和无 机盐 类，具 一 定水分 含量 的培 养基 培养 的纯菌 丝体。是传 统食 用 菌生产 使用 菌种 状态，也 用于菌种 保存。2.7 液体菌 种 liquid spawn 培养基 营养 成 份与 母种相 同、不 加琼脂 的液 体培养 基，通 过摇瓶 震荡 培养或 深层发 酵技术 快速 获得的大量 的纯 双核 菌丝 体，菌丝体 在液体 培 养基 中呈 絮状或 球状。液 体菌 种可 以作为 原种 或栽 培种 直 接 接种在固体 培 养袋 中，不能 进行菌 种保 存。3 生产要 求 3.1 人员 经过专 业培 训、掌握 白灵 菇基础 知识 及白 灵菇 菌种 生产技 术规 程要 求的 技术 人员和 检验 人员。3.2 环境 3.2.1 应选择 地势 高，通风 良好，空气 清新，水 源近，排 水通畅，交 通便 利的 场所。3.2.2 300 m 之内 无酿 造厂、无 食用菌 栽培 场、集贸 市场、规模 养殖 的畜 禽舍、垃 圾和粪 便堆 积场，无污水、废 气、废渣、烟 尘和粉 尘等 污染 源。3.3 设施 菌种生 产厂 房要 求有 各自 隔离的 摊晒 场、原 材料 库、配料分 装库。配套 有配 料室、搅 拌室、装袋（瓶）室、灭菌 室、冷 却室、接种 室、培养 室（通 风好，有纱 窗）、菌种 检测 室及 菌种 冷藏库 等各 环节 的设 施。冷却室、接 种室，培 养室 都要有 离子 净化 设施。3.4 设备 需要粉 碎机、电 子秤、搅 拌机、装袋（瓶）机、高 压灭菌 锅或 常压 灭菌 锅、离子净 化器、超 净工 作台或接 种箱、恒 温培 养箱、培养 架、摇床、液 体菌 种罐（30 L 250 L）、显 微镜等 设备。3.5 容器 3.5.1 母种生 产容 器 试管选 用18 mm180 mm 或者20 mm 200 mm；培养 皿 选用直 径7 cm 9 cm 玻 璃 培养皿 或一 次性 塑料培养皿。3.5.2 原种、栽培 种生 产容 器 3.5.2.1 固体菌 种生 产容 器 3.5.2.1.1 原种采 用850 ml 以 下、瓶 口直径 4 cm、耐 126 高温的 透明 瓶子，或 采用（1217）cm（2228）cm 的聚 丙 烯塑料 袋。DB15/T 1622 2019 3 3.5.2.1.2 栽培种 采用 同原 种要 求相 同的瓶 子，也可采 用（1517）cm（33 35）cm 的聚丙 烯塑 料袋。3.5.2.2 液体菌 种生 产容 器 3.5.2.2.1 三角瓶 液体 菌种 容器：采 用 150 ml 500 ml 三角 瓶，带滤 膜的 封口 膜。3.5.2.2.2 液体菌 种罐：采 用专 业厂 家生产 的液 体菌 种罐。3.6 培养原 料 3.6.1 硫酸镁、磷 酸二 氢钾、蛋 白胨、蔗糖、葡 糖糖、石 膏、琼 脂粉 等均 采用 分析 纯。3.6.2 马铃薯、麦 粒、谷粒、玉 米粒、柠条 粉、棉籽 壳、木屑、玉米 芯粉、豆 秸粉 要求无 霉变。4 母种生 产 4.1 生产流 程 见示例 图1。图1 菌种生产流程示例 4.2 培养基 以下培 养基 任选 其一：新 鲜无 病去 皮切 片马铃薯200 g，加 水1200 ml 煮沸 20 min，滤 液定 容 至 1000 ml，加 入硫 酸镁 0.5 g、磷 酸氢 二钾 1 g、蛋白 胨 1 g、蔗糖 10 g、葡萄 糖 10 g、琼脂粉 8 g 10 g，pH自然；新鲜无 病去 皮切 片马铃薯200 g 加水 600 ml 煮沸 20 min，滤液 定容 至 500 ml；新鲜无 霉变 的麦粒100 g 加水 600 ml 煮沸 20 min，滤 液定 容至 500 ml，二者 混合，加 入硫 酸镁 0.5 g、磷酸氢二 钾1 g、蔗糖20 g、葡萄 糖 10 g、琼 脂粉 8 g 10 g，pH 自然。4.3 分装、灭菌 4.3.1 母种培 养基 温度 降 到 90 即可 分装 至不 同容 器。4.3.2 试管母 种生 产 4.3.2.1 分装 母种培 养基 至试 管1/4 处，塞上棉 塞（硅胶 塞），用 牛皮纸 将试 管5 支一 把包 扎，棉塞（硅胶 塞）向上放入 灭菌 筐内 等待 灭菌。4.3.2.2 灭菌 121 122（0.11 MPa 0.12 MPa）保持25 min。DB15/T 1622 2019 4 4.3.2.3 冷却 灭 菌 完毕 后 自然 降压，降温 至（655）左 右时 取出 试 管，在 空气 清洁 的 室内 摆 斜面，斜面 长度不超过 试管 长度 的2/3，自 然降温 凝固 后成 斜面。4.3.3 培养皿 母种 生产 4.3.3.1 灭菌 培养基 至300 ml 500 ml 三 角瓶2/3处，用 带滤 膜的 封 口膜封 口 后 放入 灭菌 筐内。培养 皿10 个一 组，用报纸 或牛 皮纸 包好，与 培养基 一同 放入 灭菌 筐内，等待 灭菌。121 122(0.11 MPa 0.12 MPa)保持25 min。4.3.3.2 分装和 冷却 灭菌完 毕后 自然 降压，降 温 至70 5 时取 出三 角 瓶和培 养皿 放入 无菌 超净 工作台 或接 种箱 内，将三角 瓶内 培养 基摇 匀 后 快速 均 匀倒 入 无 菌培 养皿 中，培养 基占 培养 皿高 度 的1/3 1/2。迅速 盖好 上盖。自然降 温凝 固后 制成 平板 培养基。4.4 检测 抽取3%5%的 试管 和培 养皿，在28 下培 养48 h，无微 生物 长出 为灭 菌合 格。4.5 接种 4.5.1 在超净 工作 台或 接种 箱内 接种，接种 前用 紫外 灭菌 灯照 射 30 min 后打 开风 机 20 min，之 后用75%酒 精进 行表 面消 毒。4.5.2 接种的 菌 块3 mm 左 右，菌 种块接 种在 培养 皿或 试管 的中部，培 养皿 需用 石腊 膜密封。4.5.3 接菌过 程 严 格执 行无 菌操 作，接 种后 及时 贴好 标签 并做好 记录。4.6 培养 洁净的 培养 箱或 培养 室内，温度 控制 在15 25，空 气湿 度在75%以下，通风 避光 暗培 养。4.7 母种检 查 母种接 种后 第3 天、第7 天 和菌丝 体长 满培 养基 后分 别逐个 进行 检验，挑出 未 活、污染 和生 长不 良的不合格 培养 物，拿到 准备 室及时 进行 淘汰 处理。表1 白灵菇 母种 感官 要求 项目 要求 容器 完整、无损 棉塞或无菌塑料盖 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 培养基灌入量 为试管总容积的四分之一至五分之一 斜面长度 顶端距棉塞40 mm 50 mm DB15/T 1622 2019 5 表1（续）项目 要求 菌种外观 菌丝生长量 长满斜面 菌丝体特征 洁白、浓密、旺健、棉毛状 菌丝体表面 均匀、舒展、平整、无角变 菌丝体分泌物 无 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 斜面背面外观 培养基不干缩，颜色均匀，无暗斑、无色素 5 原种、栽培 种生 产 5.1 固体菌 种 5.1.1 培养基 以 下培 养基 任选 其一：A 粮食 培养 基。A1 谷 粒、麦粒或 玉米 粒 90%，柠条 粉、棉籽 壳、木屑、玉米芯 粉或豆 秸 粉 9%，石膏 1%，水分 含量（50 2）%，石灰 水调 节 pH 至 7.5。B 组合 培养 基：B1 锯 木屑 60%、玉 米 芯 19%、麸子 20%、石膏 1%、水分 含量（602）%、石灰 水调节pH 至7.5；B2 柠 条粉60%、玉米 芯 22%、麸 子15%、玉 米粉2%、石膏1%、水分 含量（602）%、石灰水 调 节 pH 至 7.5；B3 豆 秸粉60%、玉 米 芯 22%、麸子15%、玉米 粉2%、石 膏1%、水分 含量（602）%、石灰水 调 节 pH 至 7.5；B4 棉 籽壳82%、麸 子18%、石 膏1%、水分 含量（602）%、石灰 水调 节 pH 至7.5。5.1.2 装袋（瓶）培养基 的多 种组 成按 照比 例称量 干料 搅拌 均匀，边 加水边 混拌 均匀，含水 量60 2%。采用 装袋（瓶）机或人 工进 行装 袋（瓶）培养料 底部 松上 部较 紧实，人工 装袋（瓶）需 用打 孔器从 袋（瓶）口 处打 孔 致底部，孔直 径1 cm1.5 cm、深 度是 袋（瓶）的高 度，无棉 盖体 或海 绵封 口。5.1.3 灭菌 5.1.3.1 灭菌可 选择 高压 灭菌 和常 压灭菌，培养 基质 装袋（瓶）后要 求在3h 之 内使 菌 种袋 表 面温 度达到 100。5.1.3.2 常压灭 菌：保 持 100 8 h9 h。5.1.3.3 高压灭 菌：组合 培养 基维 持 121 123（0.11 MPa0.13 MPa）2 h；粮 食培养 基维 持121 123（0.11 MPa 0.13 MPa）2.5 h。5.1.4 接种 5.1.4.1 原种、栽培 种在 超净 工作 台或接 种箱 内 完 成，打开 紫外灯 照 射30 min 后打 开 风机 20 min，然后 用75%酒 精对 接种 工 具、手 进行 表面 擦拭 消毒。DB15/T 1622 2019 6 5.1.4.2 原种接 种：每支 试管 母种 接种 5 袋6 袋（瓶）原 种，每个 培养 皿母 种接 种 8 袋12 袋（瓶）原种。5.1.4.3 栽培种 接种：每 个栽 培种 接入的 原种 量 15 g20 g。原种 块 都 要求 从容 器开 口处接 种，不 能采用 打 孔多 点接 种方式。5.1.4.4 要严格 按无 菌操 作接 种，每批接 种应 为单 一品 种，如中途 换品 种时 采 用75%酒精对 超净 工 作台或接 种箱 进行 表面 擦拭 消毒。5.1.5 培养 温度控 制在21 252，空气 湿度 在75%以 下，通风避 光暗 培养。5.1.6 检验 接种后 第7天、第10 天和菌 丝体长 满袋（瓶）后，逐 个全面 检验，挑出 未活、污染和 生长不 良及 破损的不 合格 菌种 袋（瓶），拿到 准备 室及 时进 行淘 汰处理。表2 白灵菇 原种 感官 要求 项目 要求 容器 完整、无破损 棉塞或无菌塑料盖 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（50 5）mm 菌种外观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 洁白浓密，生长旺健 培养物表面菌丝体 生长均匀，无角变，无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁，无干缩 菌丝分泌物 无，允许少量无色至棕黄色水珠 杂菌菌落 无 现象及角变 无 子实体原基 无 表3 白灵菇 栽培 种感 官要 求 项目 要求 容器 完整、无破损 棉塞或无菌塑料盖 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（50 5）mm 菌 种 外 观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 生长均匀，色泽一致，无角变，无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁，无干缩 菌丝分泌物 无，允许少量无色至棕黄色水珠 杂菌菌落 无 现象及角变 无 子实体原基 允许少量，出现原基种类 5%DB15/T 1622 2019 7 5.1.7 贮存 5.1.7.1 原种和 栽培 种贮 存条 件 在1 4 下贮 存，贮存 期不超 过 70 d；在 15 20 下 贮存，贮存期 不超 过 30 d。5.1.7.2 贮存摆 放在 层架 或者 贮存 在菌种 筐内。5.2 液体菌 种 5.2.1 培养基 及制 作 以下培 养基 任选 其一：新鲜无 病去 皮切 片 马 铃薯200 g，加 水1200 ml 煮沸 20 min，滤 液定 容 至 1000 ml，加 入硫 酸镁 0.5 g、磷 酸氢 二钾 1 g、蛋白 胨 1 g、蔗糖 10 g、葡萄 糖 10 g、琼脂粉 8 g 10 g，pH自然；新鲜无 病去 皮切 片马铃薯200 g 加水 600 ml 煮沸 20 min，滤液 定容 至 500 ml；新鲜无 霉变 的麦粒100 g 加水 600 ml 煮沸 20 min，滤 液定 容至 500 ml，二者 混合，加 入硫 酸镁 0.5 g、磷酸氢二 钾1 g、蔗糖20 g、葡萄 糖 10 g、琼 脂粉 8 g10 g，pH 自然。5.2.2 三角瓶 液体 菌种 生产 5.2.2.1 装 瓶 采用150 ml 500 ml 三角 瓶，培 养基 添加 至刻 度的2/3 处，用带 滤膜 的封 口膜 封口后 灭菌。5.2.2.2 灭菌 121 122(0.11 MPa 0.12 MPa)保持25 min 灭 菌。5.2.2.3 接种和 培养 待液体 培养基 冷却 至30 以下进 行接种，接 种量取3 mm 大小10块15块 母种放 进液体 培养基 中，培养温 度（在）21 25，振荡 频率（搅 拌速 度）140 r/min 160 r/min 下振 荡培 养6 d 9 d。5.2.3 菌种罐 液体 菌种 生产 5.2.3.1 装罐和 灭菌 填装培 养基至 液体 菌种罐2/3 处，按照液 体菌 种罐说 明书要 求，对 液体 菌种罐 和液体 培养基 灭菌，待液体 培养基 冷却 至30 以下时 进行接 种。接 种方 式按照 液体菌 种罐 说明书 要求在 无菌条 件下 严格操作。5.2.3.2 接种和 培养 将 培 养 好的 三 角瓶 液体 菌种 接 入 到液 体 菌种 罐中，接 种 量 为培 养 基总 体积 的3%5%，培 养 温度（232），搅 拌转 速150 r/min 160 r/min，灌 压0.04 MPa，通 风量0.7 N m3/h，培养7 d。液体菌 种转 接不 得超 过3 次。5.2.4 检验 液体菌 种接种 后第3 天对罐 内培养 基 进行 纯度 检验，及时清 理未活 或污 染的罐 内培养 基后，对液 体菌种罐 高压 消毒。DB15/T 1622 2019 8 表4 白灵菇 液体 菌 种 种感 官要 求 项目 要求 容器 完整、无破损、无裂纹 菌丝生长量 培养基 1/21/3 菌丝体特征 白色至透明块状，生长旺健，培养基及菌丝体 清澈、无杂色 杂菌 无杂菌 6 入库 6.1 检验合 格的 固体 菌种 应及 时入菌 种库，详 细记 录各 生产环 节，液体 菌种 生产 应该随 用随 生产，不能进行 入库 保存。6.2 菌种库 温度 应 该1 4，避 光，适当 通风 但应 该对空 气进 行杀 菌处 理。母种在 库中 贮存 时间不应长 于 50 d，贮 存时 间 超出 50 d 的母 种应 该进 行 出菇检 验后 再进 行后 续生 产。6.3 每隔 20 d 进行 一次 检查，提出破 损、污染、生 产异 常 的菌 种。7 留样 各级 菌 种均应 应留 样，每 批次留 样3个（支），贮存 在1 4，贮 存至购 买者购 买后正 常生 产条件下 出第 一潮 菇。_