ICS 65.020 CCS B30 43 湖南省地方标准 DB 43/T 29902024 水产养殖环境（水体、底泥）中地西泮的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of diazepam in water and sediment from aquaculture environmentsLiquid chromatography-tandem mass spectrometry method 2024-05-13 发布 2024-07-13 实施 湖南省市场监督管理局 发 布 DB 43/T 29902024 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 方法 原理.1 5 试 剂与 材料.1 6 仪 器与 设备.2 7 样品.2 8 测定 步骤.3 9 结 果计 算和 表述.5 10 检测 方法 的灵 敏度、准 确度 和精 密度.5 附录A（资 料性）地西 泮标 准溶 液特 征离子 质 量色 谱图.6 DB 43/T 29902024 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.12020 标准 化工 作导则 第1 部 分：标准 化文 件的 结构 和起 草规 则的 规定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能 涉及 专利。本 文件的 发布 机构 不承 担识 别专 利的 责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提 出。本文件 由湖 南省 农业 标准 化技 术委 员会 归口。本文件 起草 单位：湖 南省 水产 科学 研究 所、农业农 村部 渔业 产品 质量 检验 测试 中心（长 沙）、澧县农产品 质量 安全 检测 中心、邵 阳县 畜牧 水产 事务中 心。本文件 主要 起草 人：李 小玲、万 译文、杨霄、索纹 纹、谢仲 桂、崔 先锋、曾 春芳、雷琴、谢玉 昆、何咏、陈湘 艺、黄向 荣、张永 勇、尹升 福、刘伶俐、洪 波、黄华 伟、肖维。DB 43/T 29902024 1 水产养殖环境（水体、底泥）中地西泮的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件 描述 了水 产养 殖环 境（水体、底 泥）中地西 泮的 液相 色谱-串 联质 谱测 定方 法。本文件 适用 于水 产养 殖环 境（水体、底 泥）中地西 泮的 测定。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的 规范 性引 用而 构成本 文件 必不 可少 的条 款。其 中，注日 期的 引用文 件，仅 该 日期 对应 的版 本适 用于 本文 件；不注 日期 的 引用 文件，其 最新 版本（包 括所 有的 修改 单）适用 于本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用水 规格 和试 验方法 GB 17378.5 海洋 监测 规范 第5 部 分：沉积 物分析 SC/T 9102.3 渔业 生态 环境 监测 规范 第3 部分：淡水 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和 定义。4 方法原 理 底泥试 样经 氨化 乙酸 乙酯 提取，氮 气浓 缩。底泥试 液、水体 试样 加入 甲酸 酸化，固相 萃 取柱富 集净化，液 相色 谱串 联质 谱仪 测定，内 标法 定量。5 试剂与 材料 试剂 5.1.1 水：GB/T 6682 规定 的一 级水。5.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱 纯。5.1.3 乙酸乙 酯（CH3COOC2H5）：色谱 纯。5.1.4 甲酸（HCOOH）：色谱 纯。5.1.5 氨水（NH3 H2O）：分析 纯，浓度 为25%28%。溶液配 制 5.2.1 1%氨水-乙酸 乙酯：取 氨水5 mL，用乙 酸乙酯 稀 释至 500 mL。5.2.2 1%甲酸-水 溶液：取 甲酸 10 mL，用水 稀释至 1000 mL。5.2.3 5%氨水-乙腈 溶液：取 氨水25 mL，用 乙腈 稀释 至 500 mL。5.2.4 0.1%甲酸-水溶 液：取 甲酸1 mL，用水 稀释至 1000 mL。DB 43/T 29902024 2 标准品 5.3.1 地西泮（Diazepam,C16H13ClN2O,CAS 号：439-14-5）。5.3.2 氘代地 西泮（Diazepam-D5,C16H8D5ClN2O,CAS 号：65854-76-4）。标准溶 液配 制 5.4.1 标准储 备液（100 g/mL）：取地 西泮 标准品 10 mg，精 密称 定，用乙 腈溶 解并 稀释至100 mL，配制成 浓度 为100 g/mL 的 标准 储备 液。-18 避 光保 存，有效 期12 个 月。5.4.2 内标 储备 液（100 g/mL）：取氘 代地 西泮标 准 品 10 mg，精 密称 定，用乙 腈溶 解并 稀释 至100 mL，配制 成浓 度为100 g/mL 的 内标 储 备液。-18 避光 保存，有 效期12 个 月。5.4.3 标准中 间液（1.0 g/mL）：准确 移取 地西 泮 标准储 备液 1 mL，于 100 mL 容量 瓶中，用 乙腈稀释至刻 度，配制 成浓 度为 1.0 g/mL 的 标准 中间液。-18 避 光保 存，有效 期6 个月。5.4.4 内标 中间 液（1.0 g/mL）：准确 移取 氘代 地 西泮标 准储 备液 1 mL，于 100 mL 容量 瓶中，用乙腈稀释 至刻 度，配制 成浓 度为 1.0 g/mL 的内 标 中间 液。-18 避 光保 存，有效 期6 个月。5.4.5 标准使 用液（0.10 g/mL）：准 确 移 取 5 mL 地西泮 标准 中间 液于 50 mL 容量 瓶中，用乙腈 稀 释至刻度，配 制成 浓度 为 0.10 g/mL 的 标准 使用液。4 避光 保存，现 配现 用。5.4.6 内标使 用液（0.10 g/mL）：准 确 移 取 5 mL 氘代地 西泮 内标 中间 液于 50 mL 容 量瓶 中，用乙腈稀释至 刻度，配 制成 浓度 为 0.10 g/mL 的内 标 使用 液。4 避光 保存，现 配现 用。材料 5.5.1 混合型 强阳 离子 交换 固相 萃取 小柱：150 mg/6 mL，或 相当 者。5.5.2 聚四氟 乙烯 滤膜：0.22 m。5.5.3 玻璃纤 维滤 膜：0.45 m。6 仪器与 设备 液相色 谱-串联 质谱 仪：配有 电喷 雾离 子源。分析天 平：感量0.01 g 和0.00001 g。冷冻干 燥机。涡旋混 合器。高速离 心机：转 速大 于等 于8000 r/min。超声波 清洗 器。固相萃 取装 置。氮吹仪。7 样品 样品采 集 水样和 底泥 样品 按照SC/T 9102.3 规定 的方 法进行 采集。试样制 备 水样采 样量 应不 少于 1 L，经0.45 m 玻璃纤 维 滤膜 过滤，置 于棕 色样 品瓶 中，0 4 避 光保存，一 周内 完成 分析。底泥 样品 采样 量应 不 少于 500 g，于-20 预 冷冻 24 h，经冷 冻干 燥机（-50，DB 43/T 29902024 3 真空度 小于 20 Pa，冷冻 干燥 10 h）冻干，剔除石 块和 植物 体等 异物，用研 钵研 磨后 过 孔径 0.25 mm 网筛，置 于棕 色样 品瓶 中，0 4 避 光保 存，一 个月 内完 成分 析。空白试 样制 备 选取不 含地 西泮 的同 类样 品，按照7.2 进行 制备。8 测定步 骤 提取 8.1.1 水 准确移 取100 mL 试样 置 于离 心管 中，加入 100 L 内 标使 用液，加入1 mL 甲酸 酸化，涡 旋震荡，充分混 合，8000 r/min 离心 5 min，待净 化。8.1.2 底泥 称取2 g（准确 至0.02 g）试样 于50 mL 离心管 中，加入3 mL 水润 湿，加入100 L 内标使 用液，加 入 15 mL 1%氨水-乙 酸乙 酯，涡旋 混合 2 min，超 声提 取 10 min，8000 r/min 离心 5 min，取 上清液转 移至 25 mL 比 色管 中，残渣用 10 mL 1%氨水-乙 酸乙 酯重 复提 取一 次，合并 提取液，45 氮 气吹干，加 入5 mL 乙腈 溶解，加 入250 L 甲酸涡 旋 混合，待 净化。净化 混合型 强阳 离子 交换 固相 萃取小 柱依 次用 3 mL 乙 腈和 3 mL 1%甲酸-水 溶液 活化。预 处理水 样 和底泥提取 试样 全部 转移 过柱，控 制流 速不 超过5.0 mL/min。待 试样 全部 通过 小柱 后，用3 mL 1%甲酸-水溶液和 3 mL 乙腈 淋洗，减 压抽 干，用 3 mL 5%氨水-乙腈 溶液 洗脱。收集 洗脱 液，于45下 氮 气吹 至近干。加 入1 mL 乙腈 溶解 残渣，过 0.22 m 聚四氟 乙烯 滤膜，供 液相 色谱-串联 质谱 仪 测定。底泥试 样含 水率 测定 按照GB 17378.5 规定 的方 法进 行测 定。标准曲 线制 备 分别移 取标 准使 用液 和内 标使 用液，用 乙腈 配制成 地西 泮的 质量 浓度 为0.5 g/L、1.0 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L、50.0 g/L，氘代 地西 泮质 量浓 度为10.0 g/L 的 系列 标准工 作液，供液相色 谱-串联 质谱 仪测 定。以待测 物和 内 标物特 征离 子质 量色谱 峰峰 面积 比值 为纵 坐 标、对 应的 标准溶液浓 度为 横坐 标，绘制 标准 曲线，计 算回 归方程 和相 关系 数。测定 8.5.1 液相色 谱参 考条 件 液相色 谱参 考条 件如 下：a)色谱柱：C18(100 mm2.1 mm，粒径 2.6 m)，或 相当 者；b)流动相：A 为乙 腈，B 为0.1%甲酸-水溶 液。梯度洗 脱条 件见 表1；c)进样量：5 L；d)流速：0.3 mL/min；DB 43/T 29902024 4 e)柱温：40。表1 流动相 梯度 洗脱 条件 时间 min A%B%0 10 90 0.5 10 90 4.0 95 5 6.0 95 5 6.1 10 90 8.5 10 90 8.5.2 质谱参 考条 件 质谱参 考条 件如 下：a)离子源：电 喷雾 离子 源；b)扫描方 式：正离 子扫 描；c)检测方 式：多反 应监 测（MRM）；d)喷雾电 压：5.5 kV；e)脱溶剂 气温 度：550；f)多反应 监测 母离 子、子离 子、去簇 电压 和碰 撞能量 见表2。表2 多反应 监测 母离 子、子离 子、去簇 电压 和碰 撞能量 化合物名称 母离子 m/z 子离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 地西泮 285.1 193.1a 100 44 154.1 100 40 氘代地西泮 290.1 154.1 a 100 40 a 定量 离子。8.5.3 定性测 定 在相 同测试条件 下，试样中 待测物的保 留时间与 标准工作液 中待测物的 保留时间一 致，偏差 在2.5%以内，且 试样中待测物 定性离子的 相对丰度 与浓度相当的 标准溶液对 应的定性离子的相 对丰度一致。其 允许 偏差 见表3。表3 定性确 证时 相对 离子 丰度 的最 大允 许偏 差 相对离子丰度/%50 2050 1020 10 允许偏差/%20 25 30 50 8.5.4 定量测 定 按8.5.1 和8.5.2 设 定仪 器条 件，取标 准工 作溶液、试 样溶 液、空白 试样 溶液 等体 积进 样测定，内标法定 量。标准 工作 溶液 和试 样溶 液中 目标 物的响 应值 均应 在仪 器检 测线 性范 围内。地 西泮标 准溶 液特征离子 质量 色谱 图参 见附 录A。DB 43/T 29902024 5 空白实 验 按照8.18.5 相同 的测 定步 骤进 行空 白试样（见7.3）的 测定。9 结果计 算和 表述 水样中 地西 泮含 量 水样中 地西 泮含 量按 式（1）计算。计 算结果 应 扣除 空白 值，保留 2 位有 效数 字。1=0(1)式中：1 试样 中地 西泮 的含 量，单位 为微 克每 升（g/L）；从 标准 工作 曲线 得到 的待 测物 溶液 浓度，单位 为微 克每 升（g/L）；试样 最终 定容 体积，单 位为 毫升（mL）；0 试样 体积，单 位为 毫升（mL）；底泥中 地西 泮含 量 底泥中 地西 泮含 量按 式（2）计算。计 算结果 应 扣除 空白 值，保留 2 位有 效数 字。2=(1)(2)式中：2 试样 中地 西泮 的含 量，单位 为微 克每 千克（g/kg）；从 标准 工作 曲线 得到 的待 测物 溶液 浓度，单位 为微 克每 升（g/L）；试样 最终 定容 体积，单 位为 毫升（mL）；试样 质量，单 位为 克（g）；试样 含水 率，单位 为质 量分 数（%）。10 检测方 法的 灵敏 度、准确 度和 精密 度 灵敏度 本方法 在水 产养 殖环 境水 中地 西泮 的检 出限 为0.01 g/L，定 量限 为0.02 g/L；在 水 产养殖 环境底泥中 地西 泮的 检出 限为0.5 g/kg，定量限 为1.0 g/kg。准确度 本方法 水在 0.02 g/L2 g/L 添加 浓度水 平 上的 回收 率为 70%120%；底 泥在 1 g/kg 100 g/kg 添加 浓度 水平 上的 回收 率为 70%120%。精密度 本方法 的批 内相 对标 准偏 差小 于等 于10%，批 间 相对 标准 偏差 小于 等于15%。DB 43/T 29902024 6 A A 附录A（资料 性）地西泮 标准 溶液 特征 离子 质量 色谱 图 地西泮 标准 溶液 特征 离子 质量 色谱 图见 图A.1。a）地 西泮 定量 离子 色谱 图 b）地 西泮 定性 离子 色谱 图 c）氘 代地 西泮 定量 离子 色谱 图 图A.1 地西 泮标 准溶 液特 征离 子质 量色 谱图（5 g/L）