ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 31262018 禽波氏杆 菌免疫荧 光检测技 术规范 Technical Guideline of Immunofluorescent Test of Bordetella avium 2018-02-02 发布 2018-03-02 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 31262018 前 言 本标准 按照GB/T 1.12009 给出 的规 则起 草。本标准 由山 东省 畜牧 兽医 局提出。本标准 由山 东省 畜牧 业标 准化技 术委 员会 归口。本标准 由山 东农 业大 学、山东省 动物 疫病 预防 与控 制中心 负责 起草。本标准 主要 起草 人：朱瑞 良、胡 莉萍、魏 凯、黄河、杨萍 萍、孙振 红、彭军、张华 杰、万吉 国。I DB37/T 31262018 禽 波氏杆 菌免疫荧 光检测 技术规范 1 范围 本规范 规定 了禽 波氏 杆菌 病间接 免疫 荧光 检测 技术 的试剂 或材 料、仪器 设备、禽波氏 杆菌 外膜 蛋 白（OMP）的提 取、禽波 氏杆 菌OMP 含量 测定、禽波 氏杆 菌外膜 蛋白（OMP）抗血 清的 制 备、阴性 血清 制备、禽波氏 杆菌 免疫 荧光 检测 方法和 判定 标准。本规范 适用 于山 东省 境内 从事家 禽饲 养以 及从 事家 禽防疫 活动 的单 位和 个人 禽波氏 杆菌 检测。2 规范性 引用 文件 下 列 文件 对于 本文 件的 应用 是 必不 可少 的。凡是 注日 期 的引 用文 件，仅所 注日 期 的版 本适 用于本文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 603 化学 试剂 试验 方 法中 所用 制剂 及 制品 的制备 GB/T 6682 分析 实验 室用水 规 格和 试验 方法 GB 14925 实验 动物 环境 及 设施 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 蛋白定 量Bradford法 Bradford method for protein quantitation 考马斯 亮蓝 在游 离状 态下 呈红色，最大光 吸收 在488 nm；当它 与蛋白 质结 合后 变为青 色，蛋白 质色素结 合物 在595 nm 波 长下 有 最大 光吸 收，其 光 吸收 值 与蛋 白质 含量 成正 比，因此 可用 于蛋 白质的定量测定。蛋白质 与考 马斯亮 蓝结合 在2 min左右 的时 间 内达到 平衡，完成 反应十 分迅速；其结 合物 在室 温下1 h 内保 持稳 定。该法 试 剂配制 简单，操 作简 便快 捷，反 应灵 敏，可测 定微 克级蛋 白质 含量。3.2 SDS-聚丙 烯酰 胺凝 胶电 泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE 聚丙烯 酰胺 凝胶 为网 状结 构，具 有分 子筛 效应。SDS-PAGE仅根 据蛋 白质 亚基 分子 量 的不 同就 可以分开蛋白 质。该 技术 最初由shapiro 于1967年建 立，他 们发现 在样品 介质 和丙烯 酰胺凝 胶中加 入离 子去污剂和强 还原剂（SDS，即 十 二烷基 硫酸钠）后，蛋白 质亚基 的电泳 迁移 率主要 取决于亚 基 分子 量的 大小（可以 忽略 电荷 因素），可以用 于分 离蛋 白质 和寡 核苷酸。3.3 免疫荧 光试 验 immunofluorescence test 1 DB37/T 31262018 是在免 疫学、生 物化 学和 显 微镜技 术的 基础 上建 立起 来的一 项技 术。它是 根据 抗 原抗体 反应 的原 理，先将已 知的 抗原 或抗 体标 记上荧 光基 团，再 用这 种 荧光抗 体（或 抗原）作为 探 针检查 细胞 或组 织内 的相应抗原（或 抗体）。4 试剂或 材料 4.1 禽波氏 杆菌 禽波氏 杆菌P5株，购 自中 国兽医 药品 监察 所。4.2 抗体 异硫氰 酸荧 光素(FITC)标记 羊 抗兔IgG。4.3 生化试 剂 邻苯二 胺(OPD)、聚乙 二醇辛 基 苯基 醚（Tri-tonX-100）、考马 斯亮 兰G-250、牛 血清白 蛋白（BSA）、不完全 弗氏 佐剂、丙 酮（分析纯）、乙醇（分 析纯）、甘 油（分析 纯）。5 仪器设 备 5.1 超净工 作台。5.2 恒温培 养箱。5.3 超速冷 冻离 心机。5.4 蛋白电 泳仪。5.5 微量移 液器（20 L 100 L）。5.6 电子天 平。5.7 超声波 破碎 仪。5.8 旋涡混 合器。5.9 分光光 度计（380 nm 780 nm）。5.10 荧光显 微镜。6 禽波氏 杆菌 外膜 蛋白（OMP）的提 取 6.1 将保存 的禽 波氏 杆菌 株接 种于200 mL 肉汤 培养 基中，37 振荡 培养 过夜 后，离 心 收集 过夜 培养的细菌。肉汤 培养 基配 制按 附录 A 执行。6.2 用10 倍体 积的 含有 10 mM MgCl2 的Tris-HCl（100 mM pH7.8）缓冲 液悬 浮，超声 波 破碎（功率为500 W、破碎 时间 60 s、间 隙 60 s、反复 破碎 10 次）。Tris-HCl 缓冲 液配制 按 附录 A 执 行。6.3 通过1000g 低速 离心 去除 细胞核，上 清液 高速 离心，10000g，20 min。6.4 含 全 膜蛋 白的 沉淀，用同 体积 的含 2%Triton X-100 的 Tris-MgCl2 缓冲 液溶 解，室温 下孵 育30 min降 解 内膜 蛋白 后，再进行100000g，30 min 超 速离心。6.5 沉淀用 缓冲 液再 悬浮，置-20 保存 备用。6.6 SDS-PAGE 电 泳检 测禽 波氏杆 菌 外膜 蛋白 OMP 的 分子 量。7 禽 波 氏杆菌 OMP 含量 测定 2 DB37/T 31262018 7.1 考马斯 亮蓝 法 7.1.1 取16 支试 管，1 支作 空白对照，3 支 用于 检测 禽 波氏 杆菌 OMP 样品，其余 12 支试管 分为 两组，每组6 支，用于 绘制 标准 曲线。7.1.2 用 移 液器 向每组 6 支 试管 中各加 入 1.0 mg/mL 的标 准蛋白 质溶 液 各 0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.1 mL，然 后用 去离 子 水补 充到 0.1 mL。7.1.3 各试管 中分 别加 入 5.0 mL 考 马 斯亮兰 G-250 试 剂，立即在 旋涡 震荡 器 上混 匀；空白 对照 管为0.1 mL 水与 5.0 mL 考 马斯 亮兰 G-250 试剂 的混 合液。7.1.4 加完试 剂 2 min 5 min 后，用塑 料或 玻璃 比色 皿在 分光光 度计 上测 定各 样品 在 595 nm 处 的吸光值 OD595。7.1.5 用标准 蛋白 质量（mg）为横坐 标，吸光 度值 OD595 为纵坐 标，绘制 标准 曲线。根据检测样品的 OD595值，计算 样品中 OMP 的含量。7.2 考马斯 亮蓝 微量 法 7.2.1 样品中 蛋白 质浓 度较 稀时（10 mg/mL 100 mg/mL）采用微 量法 检测。7.2.2 每支试 管的 蛋白 溶液 量加大 到 1.0 mL，加 考马 斯亮蓝 G-250 试剂 5.0 mL，根据 测定 的 OD595 值绘制标 准曲 线，计算 样品 中禽波 氏杆 菌OMP 的含 量。7.3 SDS-聚丙 烯酰 胺凝 胶电 泳 7.3.1 分别配 制 SDS-聚丙 烯酰 胺 分离胶 和浓缩 胶，安 装垂 直电泳 装置。分离 胶和浓缩 胶 配制 按附录 A执行。7.3.2 用 移 液器将 OMP 样品 加至 加样孔，进 行电 泳。7.3.3 电 泳 结束，用 考马 斯亮蓝R250 对蛋 白胶 进行 染 色，检 验 禽波 氏杆菌 OMP 的提 取效果。8 禽波氏 杆菌 外膜 蛋白（OMP）抗血 清的 制备 8.1 将 提 取的 禽波 氏杆菌 OMP 蛋白液 与弗 氏不 完全 佐剂混 合（V:V=1:1），用 漩涡振 荡 器乳 化，制备禽波氏杆 菌 OMP 免疫 用抗 原。.8.2 选取体重 2.5 kg 的健 康青紫 兰 家兔 4 只，颈背 部皮 下注射 免疫 OMP 抗 原，共免 疫 4 次，每 次间隔1 周，OMP 免 疫剂 量为 320 g/只/次。实验 兔的 饲养符 合 GB 14925 的要 求。8.3 最后1 次 免疫后 7 d 采血，检测 兔 血清 中禽 波氏 杆菌 抗 体的 凝集 价，凝 集价 高于1:256 以 上时 采血，分 离血清，-20 保存 备 用。9 阴性血 清制 备 采集未免 疫的 健康 青紫 兰兔 血 液，制备 阴性 血清。10 禽波氏 杆菌 免疫 荧光 检测 方法 10.1 被检禽 波氏 杆菌 涂片 的制 备 10.1.1 组织涂 片的 制备 3 DB37/T 31262018 取临床 疑似禽 波氏 杆菌病 的鸡肝 脏组织 进行 涂片，自然干 燥后，用冷 丙酮固 定15 min，用 灭菌PBS（配制 方法 见附 录A）洗涤34次，风干。10.1.2 阴、阳 性组 织涂 片的 制备 用移液 器吸 取5 L 培 养基培 养 的禽 波氏 杆菌 菌液 进 行涂片，自 然干 燥后，用 冷丙酮 固定15 min，用灭菌PBS 洗涤34次，风干。正常 肝脏 组织 涂片 作为 阴性对 照。10.2 检测方 法 10.2.1 向涂片 中滴 加1:10 倍稀释的 禽 波氏 杆菌 OMP 抗 血清100 L，置于 37 湿盒 中孵育 30 min，用PBS 洗涤 3 次。10.2.2 加1:100 倍 稀释 的异 硫氰 酸荧光 素（FITC）标记 的羊抗 兔 IgG 二抗，置于 37 湿盒中 孵育 30 min，用 PBS 洗涤 3 次。10.2.3 用吸水 纸吸 干后 滴 加甘 油，将 涂片 置于 荧 光显 微镜 下观察。11 判定标 准 11.1 结果有 效性 阳性对 照呈 现明 显的 黄绿 色荧光，阴 性对 照无 黄绿 色荧光，则 检测 结果 有效。11.2 结果判 定 荧光显 微镜 中出 现黄 绿色 荧光，判为 阳性，用“+”表示；未出 现黄 绿色 荧光，判为 阴性，用“”表示。阴阳 性判 定结 果按 附录B 执 行。4 DB37/T 31262018 A A 附 录 A（资料 性附 录）溶液的 配制 A.1 SDS-PAGE电泳 浓 缩胶 和分离 胶的 配制 A.1.1 5%浓缩 胶配 制 表A.1 5%浓 缩胶 配方 成分 配制不同体积 SDS-PAGE 浓缩胶 所需各成分的体积（mL）5%浓缩胶 2 3 4 6 8 10 水 1.4 2.1 2.7 4.1 5.5 6.8 30%Acr-Bis（29:1）0.33 0.5 0.67 1.0 1.3 1.7 1M Tris（pH6.8）0.25 0.38 0.5 0.75 1.0 1.25 10%SDS 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 10%过硫酸铵 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 TEMED 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.01 A.1.2 12%分 离胶 配制 表A.2 12%分离 胶配 方 成分 配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶 所需各成分的体积（mL）12%分离胶 5 10 15 20 30 50 水 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 10.0 30%Acr-Bis（29:1）2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.0 1.5M Tris（pH8.8）1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02 A.2 禽波 氏杆 菌免 疫荧 光检 测 相关 试剂 的配 制 A.2.1 1 mol/L PBS（pH 7.2）的 配方 氯化钠 8.0 g 氯化钾 0.2 g 磷酸氢 二钠 1.44 g 磷酸二 氢钾 0.24 g 双蒸水 定容至1000 mL 5 DB37/T 31262018 A.2.2 普通 肉汤 培养 基的 配方 蛋白胨 10 g 牛肉膏 粉 3 g 氯化钠 5 g 最终pH 7.40.2 A.2.3 1 mol/L Tris-Hcl 缓冲液（pH 7.8）的 配制 Tris 碱 121.1 g 浓盐酸（1 mol/L HCl）42.0 mL 双蒸水 定 容至1000 mL 在900 mL 双蒸水中加入121.1 g Tris 碱，溶液冷却至室温后调节溶液pH 值至8.0，然后定容至1000 mL，分 装后1.034105高压 灭菌30 min，室温 保存。实验室 用水 应符 合GB/T 6682的 要求。试 验中 配制 试剂 应 符合GB/T 603的要 求。6 DB37/T 31262018 B B 附 录 B（规范 性附 录）阴阳性 判定 结果 B.1 禽波氏 杆菌 免疫 荧光 检测 结果阴 阳性 对照 阳性对 照（1000）阴 性对 照（1000）_ 7