ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 35732019 牛支原体 诊断技术 规程 Code of Practice for the Diagnosis of Mycoplasma Bovis 2019-05-29 发布 2019-06-29 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 3573 2019 I 目 次.II 1.1 2.1 3.1 4.1 4.1.1 4.2.2 5.2 5.1.2 5.2.2 5.3.2 6.2 6.1.2 6.2.2 6.3 Dienes.3 6.4.3 6.5.3 7.3 7.1 DNA.3 7.2 PCR.3 7.3.4 7.4.4 7.5.4 8.4 9.5 A.6 DB37/T 3573 2019 II 前 言 GB/T 1.1 2009 DB37/T 3573 2019 1 牛 支原体 诊断技术 规程 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB 6682 2008 GB/T 14926.8 2001 GB 15981 1995 GB 19489 2008 3 术语与 定义 3.1 牛支原 体 Mycoplasma bovis 3.2 Dienes 染 色液 3.3 类胸膜 肺炎 微生 物培 养基 Pleuropneumonia-Like Organisms medium，PPLO 培养基 4 试剂及 仪器 4.1 试剂 DB37/T 3573 2019 2 GB 6682 2008 A Taq DNA Dienes TAE 4.2 仪器 5 100 L 100 1 000 L 200 L 1 mL 15 mL 90 mm CO2 1 L 5 样品采 集与 处理 5.1 疑似牛 支原 体感 牛只 的判 断 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.2 疑似病 例样 品的 采集 5.1 a)b)15 mL c)2 mL 5 mL 5.3 样品处 理 5.3.1 组织样 品的 处理 2 mL 7 500g 5 min 1 mL 0.45 m 5.3.2 鼻拭子 的处 理 2 mL 7 500 g 5 min 1 mL 0.45 m 5.3.3 奶样或 关节 液样 品的 处理 1 mL 1 mL 7 500 g 5 min 1 mL 0.45 m 6 微生物 学检 测法 6.1 液体培 养 0.5 mL 5.3 4.5 mL PPLO 37 5%CO2 3 PPLO 6.2 菌落形 态观 察 DB37/T 3573 2019 3 50 L PPLO A 37 5%CO2 3 5 4 6.3 Dienes 染色 Dienes 37 30 min 6.4 生化试 验 6.4.1 洋地黄 皂苷 敏感 试验 6.1 1:10 0.2 mg/mL PPLO 37 5%CO2 3 6.4.2 葡萄糖 发酵 试验 A 6.1 1:10 37 5%CO2 3 6.4.3 精氨酸 水解 试验 A 6.1 1:10 37 5%CO2 3 6.5 结果判 定 a)b)Dienes c)7 核酸检 测法 7.1 DNA 模 板的 制备 7.1.1 水煮法 5.3 1 mL 2 mL Eppendorf 12 000g 12 min 200 L ddH20 15 min 2 min Eppendorf 12 000g 10 min DNA 7.1.2 试剂盒 法 DNA DNA DNA 7.2 PCR 检测 DB37/T 3573 2019 4 7.2.1 PCR 反 应引 物 PCR PCR Subramaniam,et al.Molecular&Cellular Probes,1998.1 626 bp MBOUVRC2-L 5-TTACGCAAGAGAATGCTTCA-3 MBOUVRC2-R 5-TAGGAAAGCACCCTATTGAT-3 7.2.2 PCR 反 应体 系 7.1 DNA DNA ddH2O PCR 1 表1 牛支原 体PCR 反 应体 系中 各成分 添加 量 Taq 1 000 U/mL 1 L 10 2 L dNTP 10 mM 1 L 10 M 1 L 10 M 1 L 5 L ddH20 9 L 20 L 7.2.3 PCR 反 应条 件 95 5 min 95 30 s 52 30 s 72 1.5 min 36 72 10 min 4 7.3 凝胶电 泳 1.5%120 V 35 min 1 600 bp 7.4 质量控 制 1 600 bp PCR 7.5 结果判 定 1 600 bp 8 废弃物 的处 理和 检测 过程 中安全 措施 GB 19489 2008 DB37/T 3573 2019 5 9 操作注 意事 项 9.1 9.2 48 h 9.3 9.4 2 3 9.5 PCR DB37/T 3573 2019 6 A A 附 录 A（规范 性附 录）培养基 的制 备方 法 A.1 PPLO 液 体培 养基（pH 值为 7.6）PPLO 21.0 g 2.5 g 2.5 g 2.0 g 850 mL ddH2O 1%(w/v)4 mL 116 20 min GB 15981 1995 56 150 mL 20 pH 7.6 4.5 mL 15 mL 1 A.2 PPLO 固 体培 养基（pH 值为 7.6）PPLO 21.0 g 2.5 g 2.5 g 2.0 g 20.0 g 850 mL ddH2O 1%(w/v)4 mL 116 20 min GB 15981 1995 55 56 150 mL 20 pH 7.6 15 mL 90 mm 1 1 A.3 葡萄糖 发酵 试验 培养 基 PPLO 2.1 g 0.25 g 0.25 g 85 mL ddH2O 1%(w/v)0.2 mL 116 20 min GB 15981 1995 56 150 mL 20 pH 7.6 4.5 mL 15 mL 1 A.4 精氨酸 水解 试验 培养 基 PPLO 2.1 g 0.25 g 1.0 g 85 mL ddH2O 1%(w/v)0.2 mL 116 20 min GB 15981 1995 56 150 mL 20 pH 7.0 4.5 mL 15 mL 1 _