ICS 11.220 B 41 备案号：56331-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 26302017 羊传染性脓疱病毒检测 环介导等温扩增（LAMP）法 The detection of Orf virus by Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）method 2017-06-12发布 2017-08-12实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 26302017 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：程荣华、邵洪泽、呼延含蓉、柴方红、卢松岩、王楠、李文东、毛文智、刘沂霖、赵欣、石春军、陆伟、何浩、孙健。DB22/T 26302017 1 羊传染性脓疱病毒检测 环介导等温扩增（LAMP）法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了羊传染性脓疱病毒环介导等温扩增检测方法的操作步骤、结果判定。本标准适用于羊传染性脓疱病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试剂材料 3.1 试剂 3.1.1 DNA提取试剂盒 3.1.2 LAMP试剂 10Bst DNA聚合酶缓冲液（200 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L(NH4)2SO4，20 mmol/L MgSO4，1%Triton-100，pH8.8，25）；25 mmol/L MgCl2；10 mmol/L dNTPs 混合物：包括 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；8 U/L Bst DNA 聚合酶；5 mol/L Betaine；ddH2O。3.1.3 其他试剂 SYBR Green I 染料。3.2 特异性引物 引物序列，见表1（引物浓度）。DB22/T 26302017 2 表1 特异性引物序列 引物种类 引物名称 核苷酸序列 F3 5-GACCCCGAGCTCATGGT-3 外引物 B3 5-GCCGCGTCTTCACCTGTA-3 FIP 5-CCTCCTTGATGATCGCGTCGT-GACGTCTCGCTAGACGCCTA-3 内引物 BIP 5-GAGGTGTTCACGCTGGAGAAGC-AGTACTCGGGGTAGACCAC-3 环引物 LF 5-GAGCTTCTTCATGCCGCC 3 3.3 阴性对照 ddH2O。3.4 阳性对照 羊传染性脓疱病毒DNA或含目的片段的质粒。3.5 耗材 PE 无菌手套或乳胶手套；Eppendorf 离心管 1.5 mL；PCR 反应管 200 L；吸头。4 仪器设备 研磨器；振荡器；电子天平：感量 0.1 g；小型高速离心机：1 000 r/min-16 000 r/min；LAMP 仪或水浴锅（室温至 100）；微量移液器。5 操作步骤 5.1 样品前处理 采取可疑病羊或病死羊的口、鼻、唇等部位水泡、脓疱、结痂等病料（2 g）加4 mL灭菌生理盐水研磨成匀浆，反复冻融(-20)3次。将匀浆液3 000 r/min离心30 min，取上清液为检测样品。5.2 DNA模板的制备 使用试剂盒提取病毒DNA或取1 mL样品放入1.5 mL Eppendorf管中，置100 煮沸5 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液为DNA模板，-20保存备用。5.3 LAMP检测方法 DB22/T 26302017 3 5.3.1 反应体系 按下列试剂用量在PCR反应管中分别加入各成分：10Bst DNA聚合酶缓冲液：2.5 L；引物：1.0 L；25 mmol/L MgCl2：6.0 L；10 mmol/L dNTPs 混合物：3.5 L；8 U/L Bst DNA 聚合酶：1.0 L；5 mol/L Betaine：4.0 L；样品模板：1.0 L；ddH2O：6.0 L，至总体积为 25 L。引物终浓度FIP和BIP分别为0.8 mol/L，F3和B3分别为0.1 mol/L，LF和LB分别为0.4 mol/L。待检样品DNA或阳性、阴性对照均要作好标记。5.3.2 反应过程 将反应管混匀，瞬时离心后置65反应25 min，80 10 min终止反应。5.3.3 观察结果 5.3.3.1 眼观沉淀 将反应管12 000 r/min，离心1 min，观察管底白色沉淀。有沉淀者为阳性，无沉淀者为阴性。5.3.3.2 眼观颜色 反应管加入1 000SYBR Green I染料 l L，充分混匀，观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。如预先已在反应管中加入染料可直接观察。6 结果判定 在阴性对照、阳性对照成立的情况下，6.3.3.1、6.3.3.2有一项结果为阳性者判定为羊传染性脓疱病毒阳性。注：实验结果图参见附录 A。A DB22/T 26302017 4 A A 附 录 A（资料性附录）LAMP结果示图 A.1 LAMP检测结果示图 注1：阴性对照（-）；注2：阳性样品（+）；注3：阳性对照（+）；图A.1 LAMP检测方法白色沉淀图 注1：阴性对照（-）；注2：阳性样品（+）；注3：阳性对照（+）；图A.2 LAMP检测方法染料染色图 B C _