ICS 65.120 B 25 备案号：56302-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 2688.22017 饲料中三种致病菌检测 微滴数字PCR法 第2 部分：单核细胞增生李斯特氏菌 Determination of three pathogenic bacteria in feed by droplet digital PCR method Part 2：Listeria monocytogenes 2017-09-30发布 2017-11-30实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2688.22017 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 和GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。DB22/T 2688饲料中三种致病菌检测微滴数字PCR法分为3个部分：第 1 部分：沙门氏菌；第 2 部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第 3 部分：产气荚膜梭菌。本部分为 DB22/T 2688 的第 2 部分。本部分中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本部分主要起草人：王准、聂丹丹、李文君、杨帆、王玮琳、李忠起、彭勃、罗雁非、刘金华、刘韬。DB22/T 2688.22017 1 饲料中三种致病菌检测微滴数字PCR 法 第2 部分：单核细胞增生李斯特氏菌 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了饲料中单核细胞增生李斯特氏菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步骤和试验数据处理。本标准适用于饲料中单核细胞增生李斯特氏菌检测的微滴数字PCR法。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789.30-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3 原理 微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割。经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。本标准通针特异性引物和探针进行数字PCR扩增，从而对饲料中单核细胞增生李斯特氏菌进行快速检测。4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T 6682中二级水的要求。4.1 菌株：沙门氏菌阳性标准菌株。4.2 2 dd PCR预混液。4.3 李氏增菌肉汤 LB(LB1,LB2)见GB 4789.30-2016中3.3。4.4 裂解液：2%CTAB(cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，100 mmol/L Tris(tris hydroxymethyl aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，用 HCI 调至pH 8.0。4.5 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。DB22/T 2688.22017 2 4.6 氯仿。4.7 异戊醇。4.8 无水乙醇。4.9 异丙醇。4.10 70%乙醇。4.11 引物和探针 上有引物-5-CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3 下游引物-5-CGCGACCGAAGCCAACTA-3 探针-5-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-TAMRA-3 5 仪器和设备 5.1 天平：感量 0.01 g。5.2 恒温水浴锅：461。5.3 微量移液器：10 L、100 L、200 L、1 000 L。5.4 离心机：离心转速12 000 r/min。5.5 涡旋振荡器。5.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.7 微滴生成仪。5.8 PCR 仪。5.9 微滴读数系统。5.10 湿热高压蒸汽灭菌器。6 样品 按照GB/T 14699.1对饲料进行采样（6.1），单核细胞增生李斯特氏菌样品的增菌培养（6.2）按照GB 4789.30进行。7 试验步骤 7.1 模板DNA 的制备 吸取单核细胞增生李斯特氏菌增菌液1 mL（6.3），加到1.5 mL无菌离心管中，12 000 r/min离心（6.4）10 min，吸弃上清；加入50 L DNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀（6.5）后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min。取上清保存于-20备用以待检测。也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按照其说明制备模板DNA。7.2 DNA 浓度和纯度的测定 取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（6.6）测260 nm和280 nm处的吸收值，从而确定DNA浓度最优浓度范围，以便PCR扩增。7.3 微滴数字 PCR 反应体系 表1 微滴数字 PCR反应体系 DB22/T 2688.22017 3 试剂成分 体积 L 2 ddPCR 预混液 10 上游引物（10 mol/L）1 下游引物(10 mol/L）1 探针(10 mol/L）1 模板DNA（1 ng/L 100 ng/L）4 双蒸水 3 注1：空白对照实验时，用双蒸水替代样品DNA。注2：阴性对照实验时，用非目标源性成分替代样品DNA。注3：阳性对照实验时，用单核细胞增生李斯特氏菌阳性成分DNA。7.4 微滴生成 利用微滴生成仪完成20 L反应体系的分割（6.7）。7.5 PCR 反应 反应条件：95/5 min，1个循环；95/15 s，60/1 min，40个循环；98/10 min（1/s），12保存反应产物。体系完成后，进行数字PCR反应。荧光分析步骤采用FAM单荧光通道。7.6 微滴读数 数字PCR反应的有效分割体系数不得低于理论分割体系数的50%。8 试验数据处理 8.1 阈值的设定 根据数字PCR体系中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的阈值限。阈值限需要对空白和阳性扩增结果进行明显的区分。8.2 质控标准 8.2.1 阳性对照为阳性基因有明显扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值。8.2.2 阴性对照为基因无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。8.2.3 空白对照为基因无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。8.2.4 与以上实验结果不符，需要重复验证实验步骤。8.3 结果判定与报告 8.3.1 样品基因没有得到扩增，扩增终点荧光信号小于阈值，可判定样品结果为阴性，可报告未检出单核细胞增生李斯特氏菌基因。8.3.2 样品基因得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为阳性，报告检出单核细胞增生李斯特氏菌基因。9 防止污染措施 DB22/T 2688.22017 4 按照GB 19489和WS/T 230-2002中6的规定执行。_