ICS 65.020.30 B 44 DB14 山西省地方标准 DB 14/T 19422019 实验动 物 中国 地鼠 微卫 星DNA 检测方 法 Laboratory animal Method for microsatellite markers of Chinese hamster 2019-12-01 发布 2020-02-01 实施 山西省市场监督管理局 发布 DB14/T 19422019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 术语和定 义.1 3 抽样.1 4 方法.2 DB14/T 19422019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。本标准由山西省科学技术厅提出、归口并监督实施。本标准起草单位：山西医科大学。本标准主要起草人：宋国华、刘田福、陈朝阳、高继萍、张锐虎、续国强。DB14/T 19422019 1 实验动 物 中国 地鼠微 卫星 DNA 检测方 法 1 范围 本标准规定了实验动物 中国地鼠（以下简称实验中国地鼠）遗传检测抽样数量及微卫星 DNA 检测方法。本标准适用于实验中国地鼠品系鉴别、质量控制及遗传组成分析。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 实验中国地鼠 laboratory Chinese hamster 指经人工饲育，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其它科学实验的中国地鼠(Gricetulus griseus)。2.2 近交系中国地鼠 inbred strain Chinese hamster 以全同胞或亲子交配方式繁殖 20 代 以上的中国地鼠，近交系数达 98.6%以上。2.3 封闭群中国地鼠 closed colony Chinese hamster 以非近亲交配方式繁殖中国地鼠，在不从外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖 4 代以上。2.4 微卫星 DNA microsatellite DNA 是指基因组中由 1 6 个 碱基组成的串联重复序列。不同个体的重复数不同而形成了微卫星 DNA的多态性。3 抽样 对近交系中国地鼠抽样数量不做要求。每个封闭群随机抽取非同窝成年实验中国地鼠，雌雄各半。采样数量按表1 进行。DB14/T 19422019 2 表1 封闭群实验中国地鼠遗传检测抽样要求 群体数量（只）抽样数量（只）少于 100 15 大于 100 30 4 方法 4.1 采样 观察动物外观，核对编号，中国地鼠取 0.5 cm 尾尖组织或眼眶静脉丛采血，-20 低温保存。4.2 微卫星位点的选择 各微卫星位点的名称、引物序列、等位基因数、PCR 反应 的退火温度见表 2。PCR 引物的 5 端用FAM 荧光染料进行标记。近交系中国地鼠在表 2 中选择 10 个微卫星位点，封闭群中国地鼠在表 2 中选择 15 个微卫 星位点。表2 中国地鼠微卫星位点 位点 引物序列 退火温度(C)片段大小 最大等位基因数 Chm35 F:AGGCTGCTTCCTAAACCCAT 51 354-391 4 R:CTGGGAAGGCTGAACTCAAG Chm93 F:TCTGTGTGTCTGTGAATGCG 58 242-299 7 R:GGATGTAAGATGGCTCCGAA Chm147 F:CATCTGGGCTTTCAATGGAT 58 233-292 9 R:GCTCCCTAAATAACCCCCAA Chm79 F:AGGGGAGATCTTGGGTCAGT 51 270-355 5 R:AACATGGAGGAGCACAAACC Chm120 F:GATAGGAGGGAGCAAAAGGG 58 376-432 12 R:CCTGAGAGCCTCAGAGCAGT Chm162 F:TCTTCCCTTCACAACCCAAG 58 167-214 12 R:AGCAGTGCCCTTTGAAACAT Chm10 F:GGCTGGTGATTTCAATGGTT 59 217-357 5 DB14/T 19422019 3 4.3 PCR 扩增 4.3.1 提取基因组 DNA 用苯酚氯仿法或试剂盒提取基因组 DNA。4.3.2 PCR 扩增体系 PCR 扩增总 体积为 10 L，其中 DNA(20 ng/L)0.8 L，10 Buffer 1.0 L，Mg2+(25 mmol/L)0.8 L，d NTP(2.5mmol/L)0.8 L，上、下 游引物(1 pmol/L)各 0.1 L，Taq DNA 聚合酶(5 U/L)0.1 L，dd H2O 6.3 L。PCR 扩增程 序：94 预变性 5 min；94 变性 30 s，退火（退火温度见表 2）30 s，72 延伸 45 s，35 个循环；72 延伸 20 min。扩增产物 4 保存。R:GTTCTTAATGGATCTACCCTGGGACC Chm108 F:CAATGGCTGCTAAGAGAGGG 59 392-471 5 R:GTTCTTTCCCACTCACAATTTTCCTTG Chm115 F:TACTCCTGTCTCCACCTCCC 59 171-220 6 R:GTTCTTTCTGGGGGATGTATGCTCTC Chm124 F:CAGATGCCCAAACTCTCTCC 59 355-404 4 R:GTTCTTGTCACCCCATGGACTACACC Chm134 F:TGCCCACATACATGACACAA 59 383-428 5 R:GTTCTTTCCCAACACCCTCTTCTGAC Chm14 F:GACCCCATTCGTAAACCAGA 59 259-316 4 R:GTTCTTCCCCACAGTCAGCCCTATATT Chm140 F:GCAGCTGGTTTTGAGCTACC 60 168-205 7 R:GTTCTTTGTTTGATCACTGGAACCCA Chm48 F:AAAGGCCTTGAGGTGGAGTT 60 369-448 10 R:GTTCTTGAGGTAGGCAGGGACTGACA Chm54 F:AGTTTGATGATCCCCAGCAC 59 326-367 6 R:GTTCTTCTACCCCTCTCAGCAACCTG Chm9 F:GACAGATCCCGACCCATTTA 59 118-145 5 R:GTTCTTGTCCTGAGCAAGTCCAGAGC Chm91 F:GCAGAAGCACAAACCAACAA 59 104-145 7 R:GTTCTTAGGCCAAGCTCTTCTCTTCC DB14/T 19422019 4 4.3.3 PCR 产物的检测 PCR 产物，经 1.5 的琼 脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩增结果。4.3.4 扩增产物的 STR 扫描 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测确保扩增出目的片断后，选择以 FAM 蓝色荧光标记的扩增产物，取 1 L 上样 进行 STR 扫描。4.4 STR 扫描结果的判读与统计分析 4.4.1 STR 扫描结果的判读 扫描结果出现两种波形：一种为纯合基因型，只有一个主波；另一种为杂合基因型，有两个主波。同时，根据软件读出波峰处的扩增产物的碱基对数。由基因分型软件读出每个样本在每个微卫星位点的扩增片断大小。每个位点的等位基因根据扩增片断从小到大顺序排列纪录为 a，b，c，d 等。4.4.2 运用群体遗传分析软件对数据进行统计分析 将所有样本的每个微卫星位点的基因型以 ab，bb 等形式输入 群体遗传分析软件的数据文件，计算样品在各微卫星位点上的基因频率、平均观察等位基因数、平均有效等位基因数（Ne）、平均 杂 合度（H）等。4.5 结果判定 4.5.1 近交系中国地鼠 所有样品检测位点的等位基因都符合品系的特征，没有新的等位基因出现为合格的近交系中国地鼠。否则判为不合格。4.5.2 封闭群中国地鼠 群体内遗传变异采用平均杂合度指标或群体平衡状态方法进行评价。平均杂合度在 0.5 0.7 时，且期望杂合度与观测杂合度经卡方检验无明显差异时，群体为合格的封闭群中国地鼠群体。或者，首先得到各个位点上各基因频率、基因型频率的实际值，然后可计算出基因频率和基因型频率的预期值。用实际值和预期值比较，通过卡方检验，可知被监测群体是否达到平衡状态。如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群中国地鼠群体判为不合格。_