ICS 65.020.30 B 40 江 苏 省 地 方 标 准 DB32 DB32/T 36862019 山羊副流 感病毒 3 型检测技 术规程 Technical regulations for detection of Caprine parainfluenza virus 3 2019-12-04 发布 2019-12-25 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 36862019 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.12009 给出 的规 则起 草。本标准 由江 苏省 农业 科学 院提出 并归 口。本标准 起草 单位：江 苏省 农业科 学院。本标准 主要 起草 人：李文 良、毛 立、李基 棕、郝飞、刘茂 军、杨蕾 蕾、孙敏。DB32/T 36862019 1 山 羊副流 感病 毒3 型 检测技 术规程 1 范围 本标准 规定 了山 羊副 流感 病毒3 型（Caprine paraifluenza virus 3,CPIV3）的 病 原学检 测（病毒 核酸的RT-PCR 和荧 光定 量RT-PCR 检测）、血清 学检 测（血凝抑 制（HI）试 验）的 技术要 求。本标准 适用 于山 羊 副 流感 病毒3 型及 其感 染情 况 的 实 验室检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修订 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分析 实验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求 NY/T 541 兽 医诊 断样 品采 集、保 存与 运输 技术 规范 3 病原学 检测 3.1 材料 微量移 液器 及吸 头、DEPC 水处理 的离 心管、吸头、PCR 扩增 管、TRIzol 试剂、三氯甲 烷、异 丙醇、DEPC 处理 水（用 水符 合GB/T 6682 规 定）、反转 录酶/Taq DNA 聚合 酶混 合液、2 一 步法RT-PCR 反 应缓冲液、一步 法荧 光定 量RT-PCR 试 剂盒、TAE 缓冲 液、琼脂糖、核 酸染 料、引物MF/MR、引物qMF/qMR与探针（附 录A）。3.2 仪 器设 备 PCR 仪、荧 光定 量 PCR 仪、台 式冷 冻离 心机、电 泳仪和 水平 电泳 槽、凝 胶 成相仪（或紫 外透 射仪）。3.3 反 转录-聚 合酶 链式 反 应（RT-PCR）3.3.1 样品 处理 与RNA 的 提取 采集 羊 的鼻 拭子、气 管拭 子或肺 脏（样品 的采 集、保存和 运输 应符 合NY/T 541 相关 规定）。取200 L 待检 样品液至无菌无RNA 酶的EP 管中，使用TRIzol 试剂、RNA 提 取试剂盒或 自动化核酸提取仪 等方法提取RNA。3.3.2 RT-PCR 反应 RT-PCR 反应使用20 L体系：10 L 2 一步法RT-PCR 反 应 缓 冲 液、引物MF/MR 各0.5 L（10 mol/L）、0.4 L 反转录酶/Taq DNA 聚合 酶混 合液、4 L RNA 模板，4.6 L DEPC 处 理水。反应 条件 为：45 反转 录30 min；94 预变 性2 min；94 30 s，54 30 s，72 30 s，进行35个循 环；72 延伸10 min。3.3.3 结果 判定 取PCR产物10 L，在1.2%琼脂糖 凝胶中 进行 电泳，在凝胶 成像系 统中 观察结 果。样 品PCR 检测 产物电泳 后 有大 小为346 bp 的片段 判断为 山羊 副流感 病毒3型 核酸 阳性，无条 带 判断为 阴性。每次 试验应设置阴 阳性 对照，阴 阳性 对照应 不出 现或 出现 相应 大小的 条带。DB32/T 36862019 2 3.4 荧 光定 量反 转录-聚 合 酶链式 反应（荧 光定 量 RT-PCR）3.4.1 核酸 提取 与荧 光定 量RT-PCR反应 核酸提 取 同3.3.1。荧 光定 量RT-PCR 反应 使用20 L 体系：10 L 2 一步法 反 应缓冲 液，0.4 L 反转录酶，0.4 L DNA 聚合 酶，引物qMF/qMR 各0.4 L（10 mol/L），0.8L 探针，0.4L 染料，2 L RNA模板，5.2 L DEPC 处 理水。将PCR 管置于 荧 光定 量PCR 仪器 上进 行RT-PCR 扩增，程序 如下：42 5 min；95 10 s；95 5 s，60 34 s，共 进行40 个 循环。3.4.2 荧光 定量RT-PCR 结 果判定 阳性对 照扩增 曲线 呈标准 的S 曲线，且Ct 值30。阴 性对照 扩增曲 线应 为基线 下的水 平线。若样 本曲线呈S 形 曲线，且Ct 值38为阳 性；未出 现扩 增曲 线为阴 性。4 血清学 检测 血凝 抑制（HI）试验 4.1 材料 微量移 液器 及配 套吸 头、96 孔V 型微 量反 应板、生理 盐 水、1%豚 鼠红 细胞 悬液（配 制方法 见附 录B）、病毒液（相 关试 验操 作应 符合GB 19489 的 要求）、标准阳 性血 清、标准 阴性 血清。4.2 仪 器设 备 离心机、恒 温培 养箱。4.3 病 毒血 凝效 价测 定 每次HI 试验前 应对 病毒 血 凝效价 进行 测定，检 测与 判定方 法如 下：在 反应 板一 排各 孔中 加25 L 生理盐 水；第 一孔 中加25 L 病毒 分离液，按 照1:2 倍 比稀 释，最后 一孔 不加 抗原 作阴 性对照。每 孔中 再加25 L PBS；每 孔加25 L 1%豚鼠 红细胞 液，37 孵育40 min；当 红细 胞被 凝集 时，红细胞 均匀 分布 在反 应板 底部，反应 板倾 斜片 刻，红细胞 不下 滑；红细 胞未被凝集时，反应板 倾斜 片刻，可见 沉淀的红 细胞 向下滑动，形成流线。HA 效价为全部 红细胞出现 凝集 时的 最高 稀释 倍数。4.4 HI 试验 按如下 方法 进 行 HI 试验：在 96 孔 V 型 微量 反 应板各 孔中 加 25 L 生理盐水；加 25 L 经处理 的血 清于第 一孔 中，混 匀后 取 25 L 加到第 2 孔中，依 次 倍 比稀 释，从 第 2 孔加至 第 11 孔，第 11 孔混 匀后吸 取 25 L 弃去，最 后 1 孔 不加 血清 作为 对照；每 孔中 加 25 L 4 个 HA 单位 的 病毒 抗原，37 孵育 40 min；每孔加 25 L 1%豚鼠 红细胞 液，37 孵育 40 min。4.5 结 果判 定 将反应 板倾 斜70 度左右，若无凝 集反 应，则沉 淀的 红细胞 向下 滑动，呈 流线 状，记 录为 抗体 阳性。完全抑 制凝 集的 抗体 最高 稀释倍 数为 血清 的HI 抗体 滴度。抗体滴 度大于 等于16 为阳 性，小 于等于8为阴 性。若 检测发 病后双 份血 清（第 一份血 清应在 临床 症状出现 后立 即采 集，第二 份 血清 在两 周后 采集），抗 体滴度 上升4倍或4倍 以上 时，表 明羊 只近 期被 感染。DB32/T 36862019 3 附录 A（资料 性附 录）引物 A.1 引物序 列 表A.1 用于RT-PCR 和 荧光 定量RT-PCR 检 测的 引物、探针 引物 靶基因 序列（5-3）产物 MF M 基因 AGTGATCTAGATGATGATCCA 346bp MR M 基因 GTTATTGATCCAATTGCTGT qMF M 基因 GCTTGGCTTCTTTGAAATGG 150bp qMR M 基因 GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC CPIV3 Probe M 基因 FAM-CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA-TAMRA A.2 引物的 溶解 引物MF、MR、qMF、qMR 用 灭菌 的DEPC 处 理水 溶 解到浓 度为10 mol/L；CPIV3 Probe 用灭 菌 的DEPC 处理 水 溶 解到 浓度 为10 mol/L。DB32/T 36862019 4 附录 B（资料 性附 录）1%豚鼠 红细 胞的 配制 B.1 生理 盐水 配制 方法 氯化钠（NaCl）0.9 g 去离子 水加 至100 mL，121 高 压灭 菌15 min，冷 却 后保存 于2 8 冰箱 中 备用。B.2 1%豚 鼠细 胞悬 液制 备 无菌采 集豚 鼠血 液，置 于EDTA 抗凝 管中 混匀，2 8 保 存。使 用前 吸取 红细 胞悬液 置离 心管 中，加入生 理盐 水洗 涤3 次，每 次以2000 r/min 离心5 min，将血 浆、白细 胞等 充分 洗去，沉积 的红 细胞 用生理盐水 稀释 成1%的悬 液，保存于2 8 冰 箱中 备 用。