ICS 65.100.01 B 16 DB35 福建省地方标准 DB35/T 16802017 青枯病植物疫苗制备技术规程 Technical specification for manufacture of plant vaccine against bacterial wilt disease 2017-10-24发布 2018-01-24实施福建省质量技术监督局 发布 DB35/T 16802017 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业厅归口。本标准起草单位：福建省农业科学院农业生物资源研究所、福建省标准化研究院。本标准主要起草人：郑雪芳、刘波、程晓明、朱育菁、张海峰、陈德局、施璘、葛慈斌、史怀。DB35/T 16802017 1 青枯病植物疫苗制备技术规程 1 范围 本标准规定了青枯病植物疫苗的术语和定义、制备流程、质量检测、包装与贮存。本标准适用于茄科作物青枯病植物疫苗的生产。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法（ISO 3696:1987，MOD）3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 植物疫苗 plant vaccine 一种能诱导植物产生抗病性的新型生物制剂。3.2 青枯病植物疫苗 plant vaccine against bacterial wilt disease 以无致病力青枯雷尔氏菌（Avirulent Ralstonia solanacearum）为功能菌株生产出的具有诱导植物产生抗青枯病特性的诱抗制剂。4 制备流程 4.1 菌种活化 将青枯雷尔氏菌无致病力菌株在TTC固体培养基（培养基的制备见附录A）平板涂布，30 恒温培养箱培养48 h备用。4.2 种子液制备 将活化的菌株接种到体积分数为20%的SPA液体培养基(培养基的制备见附录A)中，温度为30、转速170 r/min下振荡培养15 h，然后取上述培养液按10%的接种量接种到SPA液体培养基，继续振荡培养24 h，即为种子液。4.3 发酵培养 将配制好的SPA液体培养基加入到发酵罐进行灭菌（121、30 min），待罐内的培养基温度降低至30 后，将种子液按1%接种量接种到发酵罐进行发酵培养，发酵温度为30、搅拌转速170 r/min,每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值为0.1，培养48 h。DB35/T 16802017 2 4.4 剂型制备 4.4.1 胶悬剂制备 无菌条件下，取出发酵液至贮存罐，分别添加氯化钠和2%的琼脂液至发酵液中，配成终浓度和体积分数分别为0.02 g/mL和2.5的溶液，振荡均匀至无上下分层。4.4.2 粉剂制备 往发酵液中添加适量蔗糖和麦芽糊精至终浓度分别为0.01 g/mL和0.08 g/mL，采用喷雾干燥法进行干燥，进风口温度为280，出风口温度90，雾化器运转频率400 r/min，进料速度5 L/h，干燥至粉末状。5 质量检测 5.1 胶悬剂质量检测 5.1.1 外观 浅灰色至浅黄色胶悬液体，可流动、易测量体积，存放过程中，可能出现沉淀，但经手摇动，应恢复原状，不应有沉淀结块。5.1.2 活菌量检测 吸取1 mL的植物疫苗胶悬剂，用无菌水进行10倍系列稀释至10-7，吸取0.1 mL胶悬剂稀释液，涂布在TTC固体培养基上，30 恒温培养箱培养48 h，检查并统计培养基平板上的菌落数量，菌体数量达 109 cfu/mL以上，且无杂菌，判定为合格。5.2 粉剂质量检测 5.2.1 外观 土黄色均匀疏松粉末，无可见的团块。5.2.2 活菌量检测 取1 g的植物疫苗粉剂悬浮在9 mL无菌水中，再用无菌水进行10倍系列稀释至10-8，吸取0.1 mL稀释液，涂布在TTC培养基上，30 恒温培养箱培养48 h，检查并统计培养基平板上的菌落数量，菌体数量达1010 cfu/g以上判定为合格。6 包装与贮存 6.1 采用塑料瓶或塑料袋包装。6.2 产品在 4 10 条件下冷藏保存，有效期 2年；在常温条件下贮存，有效期 6个月。DB35/T 16802017 3 A A 附 录 A（规范性附录）培养基的制备 A.1 TTC固体培养基 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride medium的制备 A.1.1 组分 10 g/L蛋白胨、1 g/L水解酪蛋白、5 g/L葡萄糖、18 g/L琼脂和0.05 g/L2,3,5-氯化三苯基四氮唑，试剂为分析纯药品。A.1.2 配制 A.1.2.1 将10 g蛋白胨、1 g水解酪蛋白、5 g葡萄糖、18 g琼脂用符合GB/T 6682-2008中的一级水定容至1 L，调pH值为7.27.5，并在121 灭菌20 min，冷却至常温后在4 条件下贮存备用。A.1.2.2 将0.05 g的2,3,5-氯化三苯基四氮唑用符合GB/T 6682-2008中的一级水定容至1 L，调pH值为7.27.5，并在121 灭菌5 min，冷却至常温后在4 条件下贮存备用。A.1.2.3 使用时，将A.1.2.1与A.1.2.2的溶液按200:1体积比混合。A.2 SPA液体培养基 sucrose peptone medium制备 A.2.1 组分 20 g/L蔗糖、5 g/L蛋白胨、0.5 g/L磷酸二氢钾和0.025 g/L硫酸镁，试剂为分析纯药品。A.2.2 配制 将符合A.1.2.1要求的组分用GB/T 6682-2008中一级水定容至1 L，调pH值为7.27.5，并在121 灭菌20 min，冷却至常温后在4 条件下贮存备用。_ DB35/T 16802017福建省地方标准青枯病植物疫苗制备技术规程DB35/T16802017*2017 年11 月第一版 2017 年11 月第一次印刷