ICS 65.020.30 B 41 DB13 河北省地方标准 DB13/T 2609 2017 禽流感病 毒与新城 疫病毒二 重 RT-PCR 检测方法 2017-11-22 发布 2017-12-22 实施 河 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB13/T 2609 2017 I 前 言 GB/T 1.1-2009 DB13/T 2609 2017 1 禽流感病 毒与新 城疫病毒 二重 RT-PCR 检测方法 1 范围 RT-PCR 2 缩略语 EB ethidium bromide DEPC diethypyrocarbonate PCR polymerase chain reaction RNA ribonucleic acid RT-PCR-reverse-transcription polymerase chain reaction dNTP deoxy-ribonucleoside triphosphate 3 试剂或 材料 LS TRIzol RNA 75%1.0 50 TAE EB 10 ug/L DEPC DNA 100 bp 2Taq MasterMix 警示:EB EB DEPC 3.1 LS TRIzol RNA 3.2:3.3 1.0 A A.1 3.4 50 TAE A A.2 3.5 EB 10 ug/L A A.3 3.6 DEPC A A.4 3.7 DNA 100 bp:100 bp 250 bp 500 bp 750 bp 1000 bp 2000bp 3.8:M-MLV 200 U/L AMV 10 U/L DB13/T 2609 2017 2 3.9 RNA 3.10:PCR dNTP RNA 3.11 dNTP 2.5mM 3.12:B B.1 10 mol/L 4 仪器设 备 4.1 PCR:4.0 99.9,0.2 mL 4.2:DNA 0.1ng 1360 1024 10 bit USB 2.0 4.3:16000 r/min 1.5 mL 12 4.4:50 V 120 V 10 mA 800 mA 0 min 999 min 4.5:4.6:4.7:,0.5 L 10 L 2 L 20 L 10 L 100 L 100 L 1000 L 4.8:100 5 样品 5.1 阴阳性 对照-20 5.2 样品的 采集 与处 理 5.2.1 采集工 具 121 2 20 min a)b)c)d)1.5 mL e)5.2.2 棉拭子 采集 1.0 mL PBS A A.5 1.5 mL 5.2.3 组织采 集 DB13/T 2609 2017 3 5.2.4 样品储 运 24 h 5.2.5 样品的 处理 5.2.5.1 棉拭子 处理 方法 4 3000 r/min 15 min 1.5 mL 5.2.5.2 组织的 处理 方法 1:5 4 3000 r/min 15 min 1.5 mL 6 操作步 骤 6.1 RNA 的 提取 6.1.1 LS TRIzol RNA 6.1.2 250 L 750 L TRIzol LS Reagent 2 min 5 min 6.1.3 250 L 1 min 5 min 4 12000 r/min 15 min 6.1.4 15 min 4 12000 r/min 15 min 6.1.5 DEPC 75%700 L 800 L 4 12000 r/min 5 min 6.1.6 50 DEPC 6.1.7 RNA 2 h RT-PCR-80 6.1.8 RNA 6.1.8.1 20 L K 1.5 mL 200 L 200 L BB5 15 s 56 15 min 6.1.8.2 250 L 15 s 5 min 6.1.8.3 12000 r/min 1min 6.1.8.4 500 L WB5 12000 r/min 1min DB13/T 2609 2017 4 6.1.8.5 12000 r/min 1min 1 3 min 6.1.8.6 1.5 mL 20 L RNase-free Water 1min 6.1.8.7 12000 r/min 1min RNA 6.1.8.8 RNA 2 h RT-PCR-80 6.2 RT-PCR 6.2.1 反转录 反应（cDNA 的合 成）RNA 11 L 2 L 10 mol/L AIV/NDV-RT 4 L 5 0.5 L 0.5 L RNA 2 L dNTP Mixture 20 L 42 1 h cDNA PCR-20 6.2.2 PCR 反应 8 L 10 L 1 L cDNA 0.5 L AIV-decF NDV-decF 0.5 AIV-decR NDV-decR PCR 94 3 min 94 10 s 56 30 s 72 25 s 30 72 5 min 4 7 试验数 据处 理 7.1 扩增产 物的 电泳 检测 1.0%1 TAE 3 L 5 L DNA 100 bp 110V 30 min 40 min 7.2 结果判 定 RT-PCR 428 bp RT-PCR 297 bp RT-PCR 428 bp 297 bp RT-PCR 428 bp 297bp RT-PCR C C.1 8 试验报 告 DB13/T 2609 2017 5 A A 附 录 A（规范 性附 录）相关试 剂的 配制 A.1 1.0%琼 脂糖 凝胶 1.0 g 100 mL 1 TAE 60 5 L 3 mm 5 mm A.2 50TAE 电 泳缓 冲液 A.2.1 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）EDTA 18.61 g 100 mL pH 8.0 A.2.2 TAE 电 泳缓 冲液（50）Tris 242 g 57.1 mL 0.5 mol/L EDTA 100 mL 1000 mL A.3 溴化乙 锭（EB）溶液 20 mg 20 mL A.4 DEPC 水 DEPC 50 L 100 mL 6 h 8 h 121 2 20 min 1.5 mL DEPC A.5 PBS缓 冲液 A.5.1 A 0.2 mol/L NaH2PO4 H2O 27.6 g 1000 mL A.5.2 B 0.2 mol/L Na2HPO4 7H2O 53.6 g Na2HPO4 127H2O 71.6 g Na2HPO4 2H2O 35.6 g 1000 mL A.5.3 0.01 mol/L pH 7.2 A 14 mL B 36 mL NaCl 8.5 g 1000 mL DB13/T 2609 2017 6 B B 附 录 B（规范 性附 录）引物 B.1 表 B.1 引 物的 浓度 和序 列 5-3 AIV-decF 10 mol/L CGT AGA CGC TTT GTC CAG AAT GC AIV-decR 10 mol/L GTC CTC ATT GCC TGC ACC ATC NDV-decF 10 mol/L CGA AGA GCC CGT TAG TCA AAT C NDV-decR 10 mol/L GTA TCT TGG CAA CCT GGG GAG AIV/NDV-RT 10 mol/L AGC AAA AGC AGG DB13/T 2609 2017 7 C C 附 录 C（规范 性附 录）禽流感 病毒 与新 城疫 病 毒RT-PCR 产 物电 泳图 M DNA 100bp 1 2 3 4 图 C.1 禽 流感 病毒 与新 城 疫病 毒RT-PCR 产物 电泳 图 _ 1 M 2 3 4 bp 250 500