ICS 11.040.55 C 30 DB61 陕西省地方标准 DB 61/T 12052018 全自动核酸提取与反应体系构建系统 Full-automatic nucleic acid extraction and Reaction set-up system 2018-11-13发布 2018-12-13实施陕西省质量技术监督局 发布 DB61/T 10252018 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 技术要求.3 5 试验方法.4 附录 A（规范性附录）标准大气压下不同温度时纯水的密度.8 DB61/T 10252018 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由陕西省食品药品监督管理局提出并归口。本标准起草单位：陕西省医疗器械质量监督检验院、西安天隆科技有限公司。本标准主要起草人：蔡虎、苗保刚、李政、田真、彭年才、韩溟、刘立科。本标准由陕西省医疗器械质量监督检验院负责解释。本标准首次发布。单位：陕西省医疗器械质量监督检验院 电话：029-33585319 地址：陕西省西咸新区沣西新城兴咸路中段 邮编：712046 DB61/T 10252018 1 全自动核酸提取与反应体系构建系统 1 范围 本标准规定了全自动核酸提取与反应体系构建系统的术语和定义、技术要求、试验方法。本标准适用于全自动核酸提取与反应体系构建，该系统由样本架、试剂架、运动系统、加样系统、核酸提取模块、核酸检测反应体系构建模块等组成。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4793.1 测量、控制和实验室用电气设备的安全要求 第1部分：通用要求 GB 4793.6 测量、控制和实验室用电气设备的安全要求 第6部分：实验室用材料加热设备的特殊要求 GB 4793.9 测量、控制和实验室用电气设备的安全要求 第9部分：实验室用分析和其他目的自动和半自动设备的特殊要求 GB/T 14710 医用电气设备环境要求及试验方法 GB/T 18268.1 测量、控制和实验室用的电设备 电磁兼容性要求 第1部分：通用要求 GB/T 18268.26 测量、控制和实验室用的电设备 电磁兼容性要求 第26部分：特殊要求 体外诊断(IVD)医疗设备 YY 0648 测量、控制和实验室用电气设备的安全要求 第2-101部分：体外诊断（IVD）医用设备的专用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 反应体系构建 reaction set-up 按照特定的步骤和配比，将参与反应的不同试剂组份进行配制混合，构建适用于样品检测的反应体系的操作过程。3.2 升温速率 heating rate 升温过程中单位时间内上升的平均温度值。3.3 温度均匀性 temperature uniformity DB61/T 10252018 2 温度到达设定温度后，加热模块不同位置的温度一致性。3.4 温度准确度 temperature accuracy 温度到达设定温度后，实际温度测定值与设置温度差值的绝对值。3.5 温度波动度 temperature fluctuation 温度到达设定温度后，恒温计时持续时间内，温度采集仪器记录的最高温度与最低温度差值的一半。3.6 移液准确性 pipetting accuracy 仪器移液模块执行移液操作时，实际移取的液体体积与设定体积之间的差值。3.7 移液精密度 pipetting precision 仪器移液模块执行移液操作时，相同体积进行多次移取时，实际移取的液体体积的一致性。3.8 反应体系 reaction system 样本经过自动加样、核酸提取、体系构建后，得到的用于后续检测的产物。3.9 交叉污染率 cross contamination rate of sample detection 在检测过程中，由于强阳性样本的存在，导致阴性样本检测呈现假阳性结果现象的发生机率。3.10 假阳性 false positive 阴性样品被检测判定为阳性的百分比。3.11 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种对特定DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法。3.12 Ct值 cycle threshold 阈值循环数（Cycle threshold），是实时监测扩增过程中，反应管内荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。3.13 标准差 standard deviation DB61/T 10252018 3 也称均方差，是各数据偏离平均数的距离的平均数，标准差是方差的算术平方根，能反映一个数据集的离散程度。3.14 变异系数 coefficient of variation 是标准差与其平均数的比，和标准差一样，都是反映数据离散程度的绝对值。其数据大小不仅受变量值离散程度的影响，而且还受变量值平均水平大小的影响。4 技术要求 4.1 核酸提取温度控制 4.1.1 升温速率 从2590，升温速率应不小于2.0/s。4.1.2 温度均匀性 不同温度测试点，温度差值应不大于2.5。4.1.3 温度准确度 测定值与设置温度差值绝对值应不大于3。4.1.4 温度波动度 应不大于2.0。4.2 移液准确性及移液精密度 在移液量程范围内，选定高、中、低3个不同的移液水平，进行检测。测定值与设定值的相对偏差、测定值的变异系数应满足表1要求。表1 移液准确性及精密度要求 体积范围 100l 100l300l 300l 相对偏差 8%5%3%变异系数（CV，%）5%3%2%4.3 反应体系性能 4.3.1 交叉污染率 阴性样品检测结果的假阳性率5%，且假阳性定量结果低于定量检测下限。4.3.2 精密度 分别对高、中、低3个不同浓度的样品进行重复检测，并对仪器构建的核酸反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，各浓度样本检测结果Ct值的变异系数（CV，%）应不大于3%。4.3.3 线性 DB61/T 10252018 4 对5倍或10倍浓度系列梯度稀释的样品（至少5个梯度）进行检测，并对仪器构建的核酸反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，各浓度样品检测结果Ct值与稀释倍数的线性相关系数r0.980。4.4 环境试验要求 应符合GB/T 14710中适用条款的要求。4.5 电气安全要求 应符合GB 4793.1、GB 4793.6、GB 4793.9和YY 0648中适用条款的要求。4.6 电磁兼容要求 应符合GB/T 18268.1、GB/T 18268.26中适用条款的要求。5 试验方法 5.1 核酸提取温度控制 5.1.1 升温速率 编辑实验程序，将核酸提取温度设置为9010，加热持续时间不少于5min，将温度传感器固定在加热装置的测试点（该测试点应尽量靠近仪器内部传感器）上。开启数据采集仪，确认仪器正常，运行程序。取250.5范围内任一温度点TA，取900.5范围内任一温度点TB，从TA到达TB经过的时间记为t，按照公式（1）计算加热装置的升温速率V升，结果应符合本标准4.1.1的要求。tT TVA B升.(1)式中：升V 升温速率；BT 900.5范围内任一温度点；AT 250.5范围内任一温度点。5.1.2 温度均匀性 编辑实验程序，分别将核酸提取温度设置为5010、7510、10010范围内的任意温度点，恒温时间15min，将温度传感器固定在加热装置的测试点（测试点应均匀分布在整个加热装置上，并尽量靠近仪器内部传感器）上。开启数据采集仪，确认仪器正常，运行程序。用数据采集仪记录加热装置的实际温度变化情况。在温度达到设置温度并稳定2min后，记录加热装置n（n12）个测试点的实际测量温度T i（i=1，2，n），分别计算Ti“最大值”及“最小值”的温度差值T，结果均应符合本标准4.1.2的要求。5.1.3 温度准确度 编辑实验程序，分别将核酸提取温度设置为6010、8010范围内的任意温度点，恒温时间不少于5min。将温度传感器固定在加热装置的测试点（该测试点应尽量靠近仪器内部传感器）上。开启数据采集仪，确认仪器正常，运行程序。用数据采集仪记录加热装置的实际温度变化情况。在温度达DB61/T 10252018 5 到设置温度并稳定2min后，计时2min，每20s记录一次测试点的实际测量温度T i（i=1，2，6），其平均值TM与“设定值”的温度差值T，应符合本标准4.1.3的要求。5.1.4 温度波动度 编辑实验程序，将核酸提取温度设置为8010范围内的任意温度点，设恒温时间15min。将温度传感器固定在加热装置的测试点（测试点应尽量靠近仪器内部传感器）上。开启数据采集仪，确认仪器正常，运行程序。用数据采集仪记录加热装置的实际温度变化情况。在温度达到设置温度并稳定1min后，每隔30s记录一次温度测值Tj（j1，2 10），持续测定10次。并按公式（2）计算各个测值的温度变化T，应符合本标准4.1.4的要求。2min maxT TT.(2)式中：T 测试所得温度波动度；maxT 测试所得温度最大值；minT 测试所得温度最小值。5.2 移液准确性及精密度 采用称重法进行检测，操作方法如下：a)使用脱气纯水进行试验；b)将仪器、纯水等置于恒温、恒湿的实验室内平衡 2小时后，开始实验。准备与仪器适配的容器，在分度值为 0.01mg 的电子天平上调零，去除容器空白质量；c)将容器放置于仪器的移液目标位置，控制移液器向容器内移取规定量纯水，在电子天平上称量其质量 M 测试,i；d)每种规定移液量，重复称量 10 次。按公式（3）计算每次的实际加入量 V 测试,i，按公式（4）计算每种加入量的移液相对误差 E，按公式（5）计算每种规定量移液的变异系数 CV，结果应符合本标准 4.2 的要求。i,i,MV测试测试.(3)式中：i,V测试实际加入量；i,M测试实际测定质量；测定温度条件下的脱气纯水密度，见附录A。%100规定规定 测试VV VE.(4)式中：E 移液相对误差；DB61/T 10252018 6 测试V 实际加样量的算数平均值。规定V 加样量设定值。112nV VSnii,测试 测试.(5)式中：S 加样量的标准偏差；n 加样量测试重复次数；i 测定次数编号，i=1，2，10；i,V测试实际加入量；测试V 实际加样量的算数平均值。5.3 反应体系性能 5.3.1 交叉污染率 5.3.1.1 检测所需材料如下：a)生产企业指定的有 CFDA注册的提取试剂盒及配套的定量 PCR 检测试剂；b)高浓度阳性样本或质控品（浓度不低于 1.0107IU/ml）及阴性血清或小牛血清；c)有 CFDA 注册的实时荧光定量 PCR 检测仪；d)可调微量移液器；e)适配耗材若干。5.3.1.2 具体检测操作方法如下：a)每次测试时，应进行最大样本量检测，且在提取过程中，阳性样本与阴性样本交替间隔排布；b)试验完成后，对构建的反应体系进行实时荧光定量 PCR 检测，记录阳性及阴性样本检测结果。5.3.1.3 计算结果：重复本标准 5.3.1.2 的步骤，完成总计 2 次检测实验。要求所有阳性样本的阳性符合率为 100%，且阴性样本的检测结果应符合本标准 4.3.1的要求。5.3.2 精密度 根据试剂的检测范围，选定高、中、低3种不同浓度的含有目标基因的质控血清或新鲜样本，进行检测。每个浓度的样本重复检测20次，并对仪器构建的核酸检测反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，记录检测结果，按公式（6）计算检测结果的变异系数，应符合本标准4.3.2的要求。%Xn X XCVnii100112.(6)式中：CV 测值的变异系数；n测定次数，n=20；i 测定的序号，i=1，2，20；DB61/T 10252018 7 iX 每次检测结果的实测值；X 1次20次检测结果的算数平均值。5.3.3 线性 根据试剂的检测范围，选定已知高浓度的目标基因质控血清或新鲜样本，按照10倍或5倍梯度稀释后（至少5个梯度），进行检测，每个浓度的样本平行检测3次，并对仪器构建的核酸反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，记录检测结果，取各浓度的Ct均值与浓度对数值进行线性回归，计算线性相关系数，结果应符合本标准4.3.3的要求。5.4 安全要求 应按照GB 4793.1、GB 4793.6、GB 4793.9和YY 0648标准规定的方法进行试验，结果应符合本标准4.4的要求。5.5 环境试验 应按照GB/T 14710规定的方法进行试验，结果应符合本标准4.5的要求。5.6 电磁兼容试验 应按照GB/T 18268.1、GB/T 18268.26中规定的方法进行试验，结果应符合本标准4.6的要求。DB61/T 10252018 8 A A 附 录 A（规范性附录）标准大气压下不同温度时纯水的密度 标准大气压下不同温度时纯水的密度见表A.1。表A.1 标准大气压下不同温度时纯水的密度表 单位为千克每立方米 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 999.840 999.846 999.853 999.859 999.865 999.871 999.877 999.883 999.888 999.8931 999.898 999.904 999.908 999.913 999.917 999.921 999.925 999.929 999.933 999.9372 999.940 999.943 999.946 999.949 999.952 999.954 999.956 999.959 999.961 999.9623 999.964 999.966 999.967 999.968 999.969 999.970 999.971 999.971 999.972 999.9724 999.972 999.972 999.972 999.971 999.971 999.970 999.969 999.968 999.967 999.9655 999.964 999.962 999.960 999.958 999.956 999.954 999.951 999.949 999.946 999.9436 999.940 999.937 999.934 999.930 999.926 999.923 999.919 999.915 999.910 999.9067 999.901 999.897 999.892 999.887 999.882 999.877 999.871 999.866 999.880 999.8548 999.848 999.842 999.836 999.829 999.823 999.816 999.809 999.802 999.795 999.7889 999.781 999.773 999.765 999.758 999.750 999.742 999.734 999.725 999.717 999.70810 999.699 999.691 999.682 999.672 999.663 999.654 999.644 999.634 999.625 999.61511 999.605 999.595 999.584 999.574 999.563 999.553 999.542 999.531 999.520 999.50812 999.497 999.486 999.474 999.462 999.450 999.439 999.426 999.414 999.402 999.38913 999.377 999.384 999.351 999.338 999.325 999.312 999.299 999.285 999.271 999.25814 999.244 999.230 999.216 999.202 999.187 999.173 999.158 999.144 999.129 999.11415 999.099 999.084 999.069 999.053 999.038 999.022 999.006 998.991 998.975 998.95916 998.943 998.926 998.910 998.893 998.876 998.860 998.843 998.826 998.809 998.79217 998.774 998.757 998.739 998.722 998.704 998.686 998.668 998.650 998.632 998.61318 998.595 998.576 998.557 998.539 998.520 998.501 998.482 998.463 998.443 998.42419 998.404 998.385 998.365 998.345 998.325 998.305 998.285 998.265 998.244 998.22420 998.203 998.182 998.162 998.141 998.120 998.099 998.077 998.056 998.035 998.01321 997.991 997.970 997.948 997.926 997.904 997.882 997.859 997.837 997.815 997.79222 997.769 997.747 997.724 997.701 997.678 997.655 997.631 997.608 997.584 997.56123 997.537 997.513 997.490 997.466 997.442 997.417 997.393 997.396 997.344 997.32024 997.295 997.270 997.246 997.221 997.195 997.170 997.145 997.120 997.094 997.06925 997.043 997.018 996.992 996.966 996.940 996.914 996.888 996.861 996.835 996.80926 996.782 996.755 996.729 996.702 996.675 996.648 996.621 996.594 996.566 996.53927 996.511 996.484 996.456 996.428 996.401 996.373 996.344 996.316 996.288 996.26028 996.231 996.203 996.174 996.146 996.117 996.088 996.059 996.030 996.001 996.97229 995.943 995.913 995.884 995.854 995.825 995.795 995.765 995.753 995.705 995.67530 995.645 995.615 995.584 995.554 995.523 995.493 995.462 995.431 995.401 995.37031 995.339 995.307 995.276 995.245 995.214 995.182 995.151 995.119 995.087 995.05532 995.024 994.992 994.960 994.927 994.895 994.863 994.831 994.798 994.766 994.73333 994.700 994.667 994.635 994.602 994.569 994.535 994.502 994.469 994.436 994.40234 994.369 994.335 994.301 994.267 994.234 994.200 994.166 994.132 994.098 994.06335 994.029 993.994 993.960 993.925 993.891 993.856 993.821 993.786 993.751 993.71636 993.681 993.646 993.610 993.575 993.540 993.504 993.469 993.433 993.397 993.36137 993.325 993.280 993.253 993.217 993.181 993.144 993.108 993.072 993.035 992.99938 992.962 992.925 992.888 992.851 992.814 992.777 992.740 992.703 992.665 992.62839 992.591 992.553 992.516 992.478 992.440 992.402 992.364 992.326 992.288 992.25040 992.212 991.826 991.432 991.031 990.623 990.208 989.786 987.358 988.922 988.479DB61/T 10252018 9 表A.2（续）50 988.030 987.575 987.113 986.644 986.169 985.688 985.201 984.707 984.208 983.70260 983.191 982.673 982.150 981.621 981.086 980.546 979.999 979.448 978.890 978.32770 977.759 977.185 976.606 976.022 975.432 974.837 974.237 973.632 973.021 972.40580 971.785 971.159 970.528 969.892 969.252 968.606 967.955 967.300 966.639 965.97490 965.304 964.630 963.950 963.266 962.577 961.883 961.185 960.482 959.774 959.062100 958.345 _