DB13/T 2595 2017 ICS 65.020 B 16 DB13 河北省地方标准 DB13/T 2595 2017 葡萄霜霉 病菌保存 技术规程 2017-11-22 发布 2017-12-22 实施 河 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB13/T 2595 2017 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由河 北农 业大 学提 出。本标准 起草 单位：河 北农 业大学、辽 宁省 农业 科学 院植物 保护 研究 所。本标准 主要 起草 人：冉隆 贤、申 红妙、李 正楠、贾 招闪、甄志 先、刘长 远、杜兴兰。DB13/T 2595 2017 1 葡萄霜霉 病菌保 存技术规 程 1 范围 本标准 规定 了葡 萄霜 霉病 菌Plasmopara viticola(Berk et Curtis)Berl.et de Toni离 体保存技术 的术 语和 定义、葡萄 霜 霉 病菌 保存 概述 和 葡 萄霜霉 病菌 保存 技术 等内 容。本标准 适用 于教 育、研究 机构、农药 研发 部门 和药 效测定 单位 等保 存葡 萄霜 霉病菌。2 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 葡萄试 管苗 In vitro Grape Plantlet 是指在 试管 等容 器中 经过 组织培 养获 得的 葡萄 苗。2.2 水琼脂 平板 Water Agar Plate 用作保 湿的 平板 培养 基。6 g琼脂，1000 mL 蒸 馏水，直径9 cm的 培养 皿每 个约 倒入10 mL。3 葡萄霜 霉病 菌保 存概 述 葡萄 霜 霉病 菌只 能在 活体 寄主上 存活，在 离体 培养 基上不 能生 长繁 殖和 保存，致使 相关 的研 究 受到限制。要 保持 对该 病 菌 持续的 研究 并排 除其 它杂 菌的干 扰，需对 葡萄 霜霉 病 菌进 行 保 存，且保 持 病菌的致 病力，并 提高 其存 活率和 稳定 性。本规 程针 对不同 的用 途，分别 对葡 萄霜霉 病菌 进行 了超 低 温保存，主要 用于 病菌 的长 期保存；真 空冷 冻干 燥保 存，主 要用 于病 菌复 壮；葡萄试 管苗 叶片 保存，主要用于 病菌 纯化，以 保证 病菌 生 物学 和遗 传学 等研 究结果 的准 确性。4 葡萄霜 霉菌 保存 技术 4.1 超低温 保存 法 4.1.1 葡萄霜 霉病 样采 集 在田间 采集 感染 葡萄 霜霉 病的新 鲜发 病叶 片，装于 保鲜袋 中，并放 置于0 4 的 保温 盒中 带回室内。4.1.2 霜霉病 样的 预处 理 用清水 冲洗 叶片，用 灭菌 棉签轻 刷叶 片表 面的 霉层；将蘸湿 的脱 脂棉 球包 住叶 柄，背 面朝 上置 于垫 有湿 纱布的 培养 皿中；培养皿 用保 鲜膜 封口，置 入光照 培养 箱中（20、12 h 光 照，18、12 h 黑 暗，相对 湿度100%）培养2 d，待其 重新 长出 干 净的霜 霉层，备 用。DB13/T 2595 2017 2 4.1.3 孢子囊 悬浮 液的 制备 用灭菌 的棉 签将 新长 出霉 层上的 孢子 囊 刷 至无 菌水 中，用 单层 擦镜 纸过 滤，去除孢 囊梗，得 到 干净的孢 子囊；用无菌 水调节 浓 度为106个/mL的 孢子 囊悬 浮液，备用。4.1.4 孢子囊 的保存 取4.1.3 中 获得 的孢 子囊 悬 浮液10 mL，加 入等 量的10%的二甲 基亚 砜（DMSO），配制成 含5%二甲 基亚砜的 孢子 囊悬 浮液。将配好 的孢 子囊 悬浮 液分 装于规 格为2.0 mL 的 冻存 管中，置于-80 的 超低 温 冰箱中 保存。待需要 霜霉 病菌 时，取出 冻存管，室 温融 化后，在2000 rpm 下 离心15 min，弃 上清，加入 无菌 水混匀并 再次 离心，用 于 清 洗孢子 囊，去除 二甲 基亚 砜，共 离心3次。用无 菌水 调节浓 度后 接种 于干 净 健康的葡 萄叶 片背 面繁 殖使 用。4.1.5 保存时 效 含5%二甲 基亚 砜的 孢子 囊 悬浮液-80 超 低温 可以 保 存至少5年，孢 子囊 的致 病 力无明 显降 低。4.2 真空冷 冻干 燥保 存法 4.2.1 霜霉病 叶冷 冻干燥 霜霉病 样采集 及 预处 理同4.1.1 和4.1.2；将4.1.2 中 准备 好的 新鲜 病 叶 的病 斑部 位剪 成2 cm2 cm 大小，放入 冷冻 干燥 机 中，在 温度 为-41、压力为13.0Pa 下 真空 冷冻 干燥36 h，直至 材料 恒重。4.2.2 真空封 装 将 真 空冷 冻干 燥后 的病 叶碎 片 取出，分 装进 规格 为20 cm30 cm 的铝 箔袋，并用 真 空封 口机 进行压缩封 口处 理，每袋30片；将分装 的材 料分 别置 于4、-20 或-80 的冰 箱中 保存。4.2.3 保存时 效 4保 存，孢子 囊具 有较 高 致病力，最 适保 存25 d 35 d；-20 低温 保存，对 孢子 囊 致病力 影响 较小，最 适保 存1年；-80 超低 温保 存，更有 利 于孢子 囊保 持较 高致 病力，适合 长期 保存。4.3 葡萄试 管苗 叶片 保存 法 4.3.1 培养基 的配 制 4.3.1.1 水琼脂 的配 制 称取6 g 琼 脂粉 加入 蒸馏 水 中，并 用玻 璃棒 搅拌，均 匀加热 使其 完全 溶解，定 容至1000 mL；取200 mL 分 装于500 mL 的 三角瓶 中，置于 高压 灭菌 锅内121 下灭 菌20 min 30 min；将灭菌 后的 三角 瓶取 出，室温放 置24 h，确定 无杂 菌生长 后待 用。4.3.1.2 葡萄培 养基 的配 制 以1/2 MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+6 g/L 琼脂（pH 值为5.8 6.0）进行 配制；DB13/T 2595 2017 3 将配制 好的 培养 基倒 入100 mL 三角 瓶内，每 瓶40 mL，把分装 培养 基后 的三 角瓶 置于高 压灭 菌锅 内121 下灭 菌20 min 30 min，待 用。4.3.2 葡萄枝 条 预 处理 与消 毒 取未木 质化 或半 木质 化的 新鲜葡 萄枝 条，去除 叶片，剪成3 cm 4 cm 长 的带 腋芽的 小段，用流水冲洗5 min；在超净 工作 台上，将洗净的茎段 用70%的酒精浸 泡30 s，再用0.1%升汞 浸泡 5 min 10 min，最后用 无 菌水 清洗4次；将消毒 后的 茎段 放在 无菌 滤纸 的 培养 皿中，剪 去茎 段上下 两端 褐化 的部 分，形态学 上端 平剪，下端剪为 马蹄 形；将剪成2 cm 2.5 cm 的带 腋 芽 茎段 接入 灭菌 好的 培养 基中，置于 培养 室内 培养（25、12 h 光照，20、12 h 黑暗）。4.3.3 葡萄试 管苗 叶片 接种 待葡萄 试管 苗 高 度达 到5 cm 以上，着 生35片叶 时，在超净 工作 台上，用 灭菌 后的剪 刀剪 取试管苗 叶片，将 剪下 的叶 片背 面朝上 放置 于倒 好 的 水琼 脂平板 上；取4.1.2 中 重新 长出 干净 霜 霉层 的 叶片，用 蘸有 无菌 水的挑 针轻 轻挑 取干 净的 霜霉病 菌，将其 接种于 试管 苗 叶 片上；接种后 将平 板密 封，置于 光照培 养箱 内培 养7 d10 d，培养 条 件同4.1.2。4.3.4 霜霉 菌 的纯化 按照4.3.3 的方 法取 出试管苗 叶片，背 面朝 上放 置于 水琼脂 平板 上，用蘸 有无 菌水的 解剖 针挑 取已接种 试 管苗 叶片 上的 霜状 霉层接 菌，培养 条件 同4.1.2，以 获得 没有 杂菌 的葡 萄霜霉 病菌。4.3.5 保存时 效 在缺乏 寄主 的季 节和 地区，可利 用葡 萄 试 管苗 叶片 在室内 对葡 萄 霜 霉病 菌进 行连续 培养 和扩 繁，4 可 以保 存30 d 35 d，20 可 以保 存10 d 12 d。_