ICS 65.020.01 B 61 DB13 河北省地方标准 DB13/T 2596 2017 苹果组培 苗繁育技 术规程 2017-11-22 发布 2017-12-22 实施 河 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB13/T 2596 2017 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由河 北农 业大 学提 出。本标准 起草 单位：河 北农 业大学。本标准 主要 起草 人：师校 欣、杜 国强、高仪、杨丽丽、许 建锋、王 燕霞、张莹、刘 婉君、成 晓华。DB13/T 2596 2017 1 苹果组培苗 繁育 技术规程 1 范围 本标准 规定 了苹 果品 种和 砧木（Malus spp.）组织 培养繁育 过 程中 的术 语和 定义、苹果 组培 苗 生产设施、培 养基 制备、组 培室消 毒灭 菌、苹果 组培 苗生产、组 培苗 质量 标准、包装、标 签和 运输 等 方面的 操 作规 程。本标准 适用 于苹 果品 种和 砧木组 织培 养 繁 育苗 木。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 注日 期的版 本适 用于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB 9847 苹果 苗木 LY/T 1882-2010 林 木组 织培 养 育苗 技术 规程 NY/T 1085-2006 苹 果苗 木繁育 技术 规程 NY/T 2306-2013 花 卉种 苗组培 快繁 技术 规程 NY/T 2719-2015 苹 果苗 木脱毒 技术 规范 3 术语和 定义 LY/T 1882-2010、NY/T 2306-2013 等 界定 的以及 下 列 术语和 定义 适用 于本 文件。为便 于使 用，以下重复 列出 了LY/T 1882-2010、NY/T 2306-2013中的某些术 语和 定义。3.1 植物组 织培 养 plant tissue culture 在无菌 条件 下，将离 体的 植物器 官、组织、细 胞以 及原生 质体，在 人工 培养 基和人 工控 制的 环 境中，使 其再 生新 植株 的过 程和技 术。LY/T 1882-2010，定义3.2 3.2 茎尖培 养 meristem culture 以植物 茎尖 为外 植体，通 过组织 培养 的方 式获 得完 整植株 的一 种生 物技 术。一般用 来进 行脱 毒 种苗的生 产，以获 得不 含检 疫及影 响植 物正 常生 长的 病毒的 植株。NY/T 2306-2013，定义3.4 3.3 培养基 medium 根据植 物营 养原 理和 植物 组织培 养的 要求，人 工配 制的营 养基 质。LY/T 1882-2010，定义3.4 DB13/T 2596 2017 2 3.4 培养基 母液 medium stock solution 按试剂 种类 和性 质分 别配 制的高 于培 养基 配方 浓度 的溶液。LY/T 1882-2010，定义3.5 3.5 灭菌 sterilization 通过物 理、化学 及一 些理 化方法，杀 灭一 切微 生物（包括 孢子 等）的过 程。NY/T 2306-2013，定义3.5 3.6 消毒 disinfection 通过物 理、化学 方法 去除 物体表 面大 部分 有害 病原 微生物（孢 子除 外）的过 程。NY/T 2306-2013，定义3.10 3.7 外植体 explant 从自然 生长 的活 体植 物上 获取的 用于 建立 植物 组培 快繁体 系的 起始 材料。NY/T 2306-2013，定义3.8 3.8 接种 inoculation 在无菌 条件 下将 消毒 后的 外植体 或 继 代、生根 组培 材料接 入培 养基 的过 程。注：改写NY/T 2306-2013，定 义3.3。3.9 初代培 养 explant culture 采集外 植体 并对 其进 行消 毒接种，将 其置 于适 宜的 培养条 件下，启 动生 长、获得最 初的 无菌 培 养材料的 过程。3.10 继代培 养 subculture 外植体 经初 代培 养后，再 次以及 以后 各次 接种 于新 培养基 继续 培养 的过 程。LY/T 1882-2010，定义3.7 3.11 丛梢 shoot clump 在适宜 条件 下，外植 体的 顶芽或 腋芽 萌发 形成 的嫩 梢会长 出新 的腋 芽，腋芽 又不断 萌发 出嫩 梢，此过程 重复 发生 而形 成 的 多芽多 梢的 集合 体。DB13/T 2596 2017 3 3.12 试管苗 plantlet in vitro 通过组 织培 养方 法获 得的 培养容 器中 的 培 养材 料。包括外 植体 初代 培养、继 代培养、生 根培 养 各阶段的 组培 材料。注：改写NY/T 2306-2013，定 义3.7。3.13 组培苗 plant propagated via tissue culture 利用植 物组 织、器官 或细 胞等作 为起 始材 料，通过 植物组 织培 养方 式生 产获 得的植 株。NY/T 2306-2013，定义3.12 4 苹果组 培苗 生产 设施 苹果组 培 苗 繁育 实验 室或 组培生产 工 厂应 包括 培养 基制备 室、洗涤 室、灭菌 室、接 种室、培 养室、制水室、储 存室（仓 库）、温室 或大 棚等 部分，面 积可视 工作（生 产）规模 确定。5 培养基 制 备 5.1 培养基 配方 5.1.1 基本培 养基 采 用MS 培养 基 或 C17 培 养基，具 体成 分分别 见附 录A 中的表 A.1 和 附录 B 中的表B.1。5.1.2 外植体 初代 培养 基 新红星 等元 帅系 品种：C17+6-苄基 腺嘌 呤（6-BA）0.5 mg/L+吲哚 丁酸（IBA）0.2 mg/L+水解酪蛋 白（CH）300 mg/L+蔗糖30 g/L+固化 剂（能 使培养 基凝 固的 最低 用量，视固 化剂 种类 确定）。除元帅 系外 的其 它苹 果品 种和砧 木：MS+6-BA 0.5 mg/L 1.0 mg/L+萘乙 酸（NAA）0.05 mg/L+蔗糖35 g/L+固 化剂（能使培 养基 凝固 的最 低用 量，视 固化 剂种 类确 定）。5.1.3 继代培 养基：基 本培 养 基MS（C17）+6-BA1.0 mg/L 3.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+蔗糖 35 g/L+固化 剂（同 5.1.2）。5.1.4 生根培 养基：1/2MS（1/2C17）+IBA 0.3 mg/L0.6 mg/L+吲哚 乙酸（IAA）1.0 mg/L+蔗糖 25 g/L+固 化剂（同5.1.2）。5.1.5 不同苹 果品 种 或 砧木 组织 培养时，培养 基中 生长 调节 物质的 浓度 可根 据以 上配 方给出 的浓 度 范围适当 调整。5.1.6 为降低 成本，蔗 糖可 用等 量食用 白砂 糖代 替。5.2 母液配 制 5.2.1 母液配 制选 用化 学纯 以上 纯度 的 化学 试剂，使 用蒸 馏水或 去离 子水。DB13/T 2596 2017 4 5.2.2 根据附 录A 中 表A.1 和附录 B 中 表 B.1 的 基本 培养 基配方 成分 分组 和浓 度扩 大倍数，分别 配 制大量元 素（50 倍）母液、钙元素（50 倍）母 液、微 量元素-1（200 倍）母液、微量 元素-2（500 倍）母液、铁元 素（100 倍）母液和 有机 物（100 倍）母液。5.2.3 植物生 长调 节物 质配 制 成 单一 成 分母 液，浓度 以方 便使用 为原 则，一般 为0.1 mg/ml0.5 mg/ml。5.2.4 培养基 母液 试剂 瓶分 别贴 上标签，标 注母 液名 称、配制倍 数和 日期，置 于 冰 箱冷藏 保存。有 机物母液、铁 元素 母液 和植 物生长 调节 物质 母液 应储 存在棕 色试 剂瓶 中。5.3 培养基 配制 程序 5.3.1 根据培 养基 配方 与培 养基 配制数 量，计算各 种母 液的 用量 及 配方 中其 它成 分 的 用量，登记 在册，以备查 证。5.3.2 按照计 算结 果称 量固 化剂 与蔗糖（或 白砂 糖），加入 已温热 的蒸 馏水 中，蒸馏 水的量 以培养基配制体积 的1/2 2/3 为宜，不断 搅拌，熬 至沸 腾。5.3.3 在熬开 的锅 内加入 相应 母 液，加 蒸馏 水定 容，充分 搅拌均 匀。5.3.4 用1.0 mol/L 盐酸或 1.0 mol/L 氢氧 化钠 调节pH 值至 5.8 6.0。5.3.5 将培养 基分 装到 培养 容器 中，用 封口 膜、封口 盖或 棉塞加 牛皮 纸封 口。5.3.6 将培养 基放 入高 压蒸 汽灭 菌 器内 灭菌。灭 菌温 度 121，灭菌 时间20 min。5.3.7 灭菌后 的培 养基 在干 净、阴凉的 室内 常温 平放 保存，保存 时间 不 宜 超过 2 周。6 组培室 消毒 灭菌 工作 细则 组培室 保持 清洁 卫生，消 毒灭菌 工作 细则 参见 附录C。7 苹果组 培苗 生产 7.1 无菌接 种操 作 7.1.1 利用超 净工 作台 提供 的无 菌环境 进行 接种，使 用超 净工作 台接 种前 应提 前 20 min 开机 及紫 外灯。接 种前 关闭 紫外 灯，用75%的酒 精擦 拭工 作台 台面及 玻璃 内壁。7.1.2 用于切 分外 植体 或无 菌组 培材料 的培 养皿、不 锈钢 小盘等 需事 先 高 压灭 菌。7.1.3 刀、镊 子等 接种 工具 用酒 精擦拭 或浸 泡，再用 电热 接种工 具灭 菌器（280 320）或 酒精 灯灼烧灭 菌后，置 搁置 台上 冷却至 常温 使用。7.2 外植体 初代 培养 7.2.1 外植体 采集 及处 理 7.2.1.1 选择品 种纯 正或 砧木 类型 一致、性状 稳定、生 长健 壮、无 病虫 危害 和机 械损 伤的 植 株。DB13/T 2596 2017 5 7.2.1.2 在春季 采集 由叶 芽萌 发长 出几片 小幼 叶的 幼嫩 新梢、未木 质化 或半 木质 化新 梢，去 除新 梢 上展开的 叶片，未 展开 的小 幼叶可 不去 除。亦可 选用 一年生 枝，将基 部浸 于水 中室内 催芽，待 叶芽 萌 动长出幼 嫩新 梢后 及时 采集。7.2.1.3 将外植 体表 面用 自来 水冲 洗干净，较 长新 梢剪 段，置于瓶 中。7.2.2 外植体 消毒 7.2.2.1 按照7.1 的 要求 准备 好超 净工作 台及 接种 工具。7.2.2.2 使用5%次 氯酸 钠溶 液，消 毒时 间 10 min 15 min；使 用0.1%氯 化汞 溶液，消 毒 时间 6 min 15 min。消 毒时 间可 根据 材料的 幼嫩 程度、洁 净程 度适当 调整。7.2.2.3 消毒期 间多 次晃 动消 毒容 器，以 保证 外植 体与 消毒 剂充分 接触。7.2.2.4 外植 体消 毒完 成后，用 无菌水 冲 洗 4 遍 以上。7.2.2.5 使用过 的氯 化汞 废液 禁止 随意倾 倒，应妥 善收 集保 存，交 由当 地环 保部 门处 理。7.2.3 外植体 切分 接种 7.2.3.1 长度1 cm 以下 的幼 嫩新 梢 去掉外 围叶 片，基部 切出 新鲜切 口，接入 培养 基；较长的 新梢 切单节茎 段，节位 密集 时，亦可切 双节 或多 节茎 段接 种。7.2.3.2 每瓶 接1 个 3 个外 植体，要求 分布 均匀，深 浅适 中。7.2.3.3 封好瓶 口后，注 明品 种代 号、接 种人 员、接种 日期 等，放 至培 养室 培养。7.2.3.4 外植体 出现 褐化 时要 频繁 多次转 接，减轻 毒害。7.2.3.5 元帅系 品种 初代 培养 较难，可在 接种 后常 规培 养 1 周，然 后 暗 培养1 周，再 常规培 养。暗 培养可将 材 料 置于 培养 室中 的暗培 养橱，或 在培 养架 用黑布 遮盖。7.2.3.6 利用茎 尖培 养脱 除病 毒培 育无病 毒原 种和 无病 毒苗 时，应剥取 0.1 mm 0.2 mm 的 茎尖 分生组织（带 1 个或 2 个 叶原 基）作 为外 植体 接种。7.3 继代与 增殖 培养 7.3.1 将 初代 或继 代培养 材料，去除基 部愈 伤组 织、老化 组织及 生长 不良 的组 织，切分 成 0.5 cm 1.5 cm 大 小的 丛梢 或茎 段，接入 继代 培养 基，置于 培养室 培养。7.3.2 接种数 量根 据培 养容 器的 大小决 定，要求 材料 摆布 均匀，间 距1.0 cm 2.0 cm。7.3.3 培养4 周6 周，继代 苗 生 长缓慢 至停长 时，及时 进 行继代 转接。个别 苹果 品 种或砧 木（如苹果砧木 难咽 等）继代 苗停 长后衰 老速 度较 快，应适 当缩短 继代 间隔 时间。7.3.4 继代增 殖阶 段，如 遇继代 苗 发生“玻 璃化”，在继 代培 养基中 添加 1 g/L 3 g/L 聚乙烯 醇（PVA），可有效 防止 玻璃 苗发 生，也可使 部分 玻璃 化程 度较 轻的试 管苗 恢复 正常。7.4 生根培 养 7.4.1 继代培养 4 周6 周 后，切取长 度大 于 2 cm 的单根 粗壮嫩 梢插 入生 根培 养基，接种 数量 参见7.3.2。DB13/T 2596 2017 6 7.4.2 接种后 放至 培养 室培 养，元帅系 品种 先暗培养 1 周，再常 规培养，有助 于提 高生根 效果。7.4.3 富士等 多数 苹果 品种 需连 续继代 培 养 8 代 10 代 以 上才能 获得 较高 且稳 定 的 生根率。7.5 培养条 件 外植体 初代 培养、继 代增 殖、生 根培 养各 阶段 的 接 种材料 均放 至培 养室 培养，培养 条件 为，温度：（252），光 照强 度：1500 Lx 2000 Lx，光周 期：14 h 16 h光照 时 间，8 h10 h黑暗 时间。7.6 试管 苗 移栽 7.6.1 移栽适宜 条件 生根苗 出瓶 移栽 应先 在温 室（或 大棚）进 行 锻 炼和 过渡移 栽。温室（或 大棚）的 最 适温 度25，最低温 度10，最 高温 度10 cm，从 移 栽容器 中倒 出，带基质 土 坨移栽 至田 间。7.6.6.3 移栽前 加强 通风 炼苗，控 制 浇水。高 温季 节移 栽 应 适当遮 阴。7.7 苹果无 病毒 苗培 育 脱毒方 法及 病毒 检测 方法 按NY/T 2719-2015执行。经病毒 检测 确认 脱除 了病 毒的材 料进 行组 织 培养繁 育 可按照7 的规 定执行。DB13/T 2596 2017 7 8 试管苗 及 组 培苗 质量 标准 8.1 试管苗 质量 标准 适宜出 瓶移 栽的 合格 试管 苗应无 污染，具有3 条以 上 不定根，根 长适 中，最好 有侧根 发出，幼 茎粗壮，茎 基部 没有 或仅 有少 量 愈伤 组织，叶 片发 育良 好，无 黄叶，无 枯尖。8.2 组培苗 质量 标准 出圃的 组培 苗质 量标 准按GB 9847 执行。9 包装、标签 和运 输 9.1 试管 苗 包装、标 签和 运输 试管 苗 应放 于泡 沫箱 中，用填充 物固 定好，高 温季 节加冰 袋，泡沫 箱用 胶带 密封。标签 标明 品种、瓶苗数 量、包装 时间 等。码放禁 止 上 下倒 置，运输 过程避免 剧 烈颠 簸。9.2 组培 苗 包装、标 签和 运输 组培苗 的包 装、标签 和运输 按照GB 9847 的规 定执 行。DB13/T 2596 2017 8 附 录 A（规范 性附 录）MS 基 本培 养基 配方 表A.1 规定 了MS 培养 基 的 配 方。表A.1 MS 培养 基成 分及 母 液配制 表 母液种类及倍数 试剂 配方规定量 mg/L 配制 1 升母液所需量 g 大量元素 50 x KNO3 1900 95 NH4NO3 1650 82.5 M g S O 4 7 H 2 O 370 18.5 KH2PO4 170 8.5 钙元素 50 x C a C l 2 2 H 2 O 440 22 铁元素 100 x N a 2 E D T A 2 H2O 37.3 3.73 F e S O 4 7 H 2 O 27.8 2.78 有机物 100 x VB1 0.1 0.01 VB6 0.5 0.05 烟酸 0.5 0.05 甘氨酸 2 0.2 肌醇 100 10 微量元素-1 200 x M n S O 4 4 H 2 O 22.3 4.46 Z n S O 4 7 H 2 O 8.6 1.72 H3BO3 6.2 1.24 KI 0.83 0.166 微量元素-2 500 x N a 2 M o O 4 2 H 2 O 0.25 0.125 C u S O 4 5 H 2 O 0.025 0.0125 CoC l 2 6 H 2 O 0.025 0.0125 DB13/T 2596 2017 9 附 录 B（规范 性附 录）C17 基本培 养基 配方（适 合 元帅系 品种）表B.1 规定 了C17 培养 基的 配 方。表B.1 C17 培 养基 成分 及母 液配制 表 母液倍数 试剂 配方规定量 mg/L 配制 1 升母液所需量 g 大量元素 50 x KNO3 1400 70 NH4NO3 300 15 M g S O 4 7 H 2 O 150 7.5 KH2PO4 400 20 钙 元素 50 x C a C l 2 2 H 2 O 150 7.5 铁元素 100 x F e S O 4 7 H 2 O 27.85 2.79 N a 2 E D T A 2 H 2 O 37.25 3.73 有机物 100 x 甘氨酸 2 0.2 烟酸 0.5 0.05 VB1 1 0.1 VB6 0.5 0.05 D-生物素 1.5 0.15 微量元素-1 200 x M n S O 4 4 H 2 O 11.2 2.24 Z n S O 4 7 H 2 O 8.6 1.72 H3BO3 6.2 1.24 KI 0.83 0.166 微量元素-2 500 x C u S O 4 5 H 2 O 0.025 0.0125 C o C l 2 6 H 2 O 0.025 0.0125 DB13/T 2596 2017 10 附 录 C（资料 性附 录）组培室 消毒 灭菌 工作 细则 C.1 接种 室消 毒灭 菌工 作 细则 C.1.1 每 天清 洁接 种室 地 面、窗 台、超净 工作 台等，去除 灰尘 污物。C.1.2 晴 朗、无风 或微 风、无雾 霾或 其它 污染 物的 良好天 气时，可 开窗 通 风0.5 h 1 h。C.1.3 按 照每15 m2配置1 根30 w 紫外 灯，每1 g 臭氧可 杀 菌 20 m3的标 准，每天用 紫外 灯照 射杀 菌1 h，每周2 次 3 次臭 氧 消毒。杀菌 时切 勿进 入，注意安 全。C.1.4 每 周用75%酒精 溶 液作喷 雾降 尘处 理 1 次，用 84 消毒 液拖 地消 毒1 次。C.1.5 定 期（一般2 个 3 个月）清 洁超 净工 作台 的初级 过滤 网或 无纺 布。C.1.6 每 月清 洁空 调过 滤 网 1 次。C.1.7 每 月清 洗接 种工 具 灭菌器 内石 英 珠1 次，清洗 时加洗 洁精 搓洗，无明 显黑 渍后用 清水 冲洗 干净，自然晾 干后 继续 使用。C.2 培养 室消 毒灭 菌工 作 细则 C.2.1 每 天清 洁地 面、窗 台、培 养架 面等，去 除灰 尘污物。C.2.2 晴 朗、无风 或微 风、无雾 霾或 其它 污染 物的 良好天 气时，可 开窗 通 风0.5 h 1 h。C.2.3 每 周用84 消 毒液 拖地消 毒 1 次。C.2.4 每 周分 别用 紫外 灯 照射杀 菌1 h、臭氧 消毒1 次。C.2.5 每 天观 察、及时 清 理污染 的试 管苗，污 染材 料需高 压灭 菌后 再清 洗。C.2.6 每 月清 洁空 调过 滤 网 2 次。C.3 培养 基制 备室、洗 涤 室、灭 菌室、工 作区 域走 廊消毒 灭菌 工作 细则 C.3.1 每 天清 洁地 面、窗 台、工 作台 面、各类 物体 表面等，去 除灰 尘污 物。C.3.2 晴 朗、无风 或微 风、无雾 霾或 其它 污染 物的 良好天 气时，可 开窗 通 风0.5 h 1 h。C.3.3 每 周用84 消 毒液 拖地消 毒 1 次。C.3.4 每 月臭 氧消 毒1 次。