ICS 65.020.40 B 65 DB41 河南省地方标准 DB41/T 13762017 泡桐丛枝 病植原体 保存体系 建立规范 2017-04-24 发布 2017-07-24 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 13762017 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性 引用 文件.1 3 术语和 定义.1 4 泡桐丛 枝病 植原 体培 养.2 5 泡桐丛 枝病 苗植 原体 鉴定.3 6 泡桐丛 枝病 植原 体保 存.3 7 档案管 理.4 DB41/T 13762017 II 前 言 本标准按 照GB/T1.1-2009 给出的规 则起草。本标准由 河南省 林业厅 提 出并归口。本标准起 草单位：河南 农 业大学、河南省 林业科 学 研究院。本标准主 要起草 人：范 国 强、翟晓 巧、赵 振利、邓 敏捷、董 焱鹏、曹喜兵、李永生。本标准参 加起草 人：王 燕 军、张变 莉、孙 晓薇、马 向阳、马 永亮、赵利新、牛苏燕、刘玟杉、魏振峰、杨国强。DB41/T 13762017 1 泡 桐丛枝 病植原体 保存体 系建立规 范 1 范围 本标准规 定了泡 桐丛枝 病 植原体保 存体系 建立的 术 语和定义、泡桐 丛枝病 植 原体培养、鉴定、保存和档 案管理。本标准适 用于泡 桐丛枝 病 植原体保 存体系 的建立。2 规范性 引用 文件 下列文件 对于本 文件的 应 用是必不 可少的。凡是 注 日期的引 用文件，仅注 日 期的版本 适用于 本文件。凡 是不注 日期的 引 用文件，其最新 版本（包 括所有的 修改单）适用 于 本文件。NY/T 2306-2013 花卉 种 苗组培快 繁技术 规程 3 术语和 定义 下列术语 和定义 适用于 本 文件。3.1 泡桐丛枝 病 由于植原 体侵染 引起，造 成泡桐的 枝、叶、干、花、根部 均表现 畸形。隐芽 大量萌发，侧 枝丛生，纤细，呈扫帚 状。叶 小，黄化，有时皱 缩。花 瓣变叶状，花柄 或柱头生 出小枝，花萼变 薄，花托多裂，花蕾变 形，幼 苗 病后矮化。3.2 泡桐丛枝 病植原 体 引起泡桐 发生丛 枝病的 一 类无细胞 壁的原 核微生 物，存在于病 枝、叶韧 皮部 筛管中，可 穿过筛板扩散和 侵蚀细 胞壁，在 细胞内呈 现球形、长 杆形、椭圆 形、梭形等 多种形 态，大 小为200 nm820 nm。3.3 植物组织 培养 在无菌条 件下，将离体 的 植物器官（如根、茎、叶、花、果 实、种 子等）、组织（如 形成层、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和 生殖细 胞）或原 生质体等，在 配制的 培养 基上进行 培养，在人 工控制适宜 的光照 和温度 条 件下，使 之生长、分化 并 发育成完 整植株 的培养 技 术。3.4 外植体 植物组织 培养中 作为离 体 培养材料 的植物 活体，包 括完整植 株、胚 胎或从 植 物体上切 取的器 官、组织等材 料。3.5 植物激素 DB41/T 13762017 2 是植物自 身代谢 产生的 一 类有机物 质，并 自产生 部 位移动到 作用部 位，在 极 低浓度下 表现出 显著生理效 应的微 量物质，也被称为 植物内 源激素。3.6 植物生长 调节物 质 人工合成的对植物的生长发 育有调节作用的化学物质，与植物激素具有相似生 理和生物学效应。3.7 培养基 在植物组 织培养 过程中，由人工配 制的提 供培养 材 料生长所 必需的 营养元 素 和某些植 物生长 物质的基质。组成 成分有 水、氮源、无机盐（包括 微 量元素）、碳源、植物 生 长调节物 质等。3.8 芽诱导 将培养材 料在一 定的诱 导 培养基中 进行培 养，培 养 材料分化 出不定 芽的过 程。3.9 生根培养 把不定芽 转移到 生根诱 导 培养基中 诱导生 根，形 成 完整植株 的过程。3.10 繁殖系数 一个培养 周期内 不定芽 增 殖倍数，即培养 一个周 期 后增殖的 不定芽 数/接种 时的不定 芽数。3.11 巢式PCR 一种变异的 聚合酶 链反应（PCR），通过两轮PCR反 应，使用两 套引物 扩增特 异性的DNA 片断。第二对引物 的功能 是特异 性的扩增位 于首轮PCR 产 物内的一段DNA片断，巢 式PCR的扩 增具有很 强的特异性。4 泡桐丛 枝病 植原 体培 养 4.1 泡桐丛 枝病 无菌 苗培 养 取患有丛 枝病泡 桐的当 年 生幼嫩丛 枝，用 质量分 数 为0.1%的HgCl2 消毒5 min，再用无 菌水清 洗5次后接种 于不含 任何植 物激素的PC 基本 培养基 上，培养基 中蔗糖 浓度20 gL-1，琼 脂浓度6 gL-1，培养温度25 2，光 照强度130 moLm-2s-1，光照时间16 hd-1。40 d 可获得2 3 对叶片的泡桐丛枝 病无菌 苗。4.2 芽诱导 将4.1中获 得的泡桐 丛枝 病无菌苗叶 片剪成 面积约0.5 cm1 cm的小 块外植 体，分别接 种在附加不同浓 度0.1 mgL-1NAA 1.5 mgL-1NAA 和3 mgL-16-BA12 mgL-16-BA 的MS 培养基上，培养 基中蔗糖质量浓 度为25 gL-1，琼脂4 gL-1。按照4.1 规 定的培养 条件培 养20d即 可出芽。4.3 根诱导 当诱导出 的芽长 到约3 cm时，从 茎基部 剪下，分别 放入附加 不同浓 度0 mgL-1NAA0.5 mgL-1NAA的1/2 MS（大 量元素 减半 的MS培养 基）生 根培养 基 上，培养 基中蔗 糖质量 浓 度为25 gL-1，琼 脂4.5 gL-1。按照4.1 规定的 培 养条件下 生根培 养。培 养20d，可形 成完整 根系的 初代培养 苗。DB41/T 13762017 3 5 泡桐丛 枝病 苗植 原体 鉴定 5.1 泡桐丛 枝病 苗DNA 提取 将初代培 养苗顶 芽剪下，用蒸馏水 清洗干 净后，再 用滤纸吸 干材料 上的水 分，经液氮 速冻后，保存到-80 冰箱中，用于DNA提取。泡桐基因组DNA的提 取采 用离心柱型 植物基 因组DNA 提取试剂 盒，提取 步骤 参照植物基 因组DNA提取说明 书，并 将提取 泡 桐基因组DNA 溶于100 L TE中，-20 保存备用。5.2 泡桐丛 枝病 植原 体巢 式PCR 检测 泡桐丛枝 病植原 体的鉴 定 采用巢式PCR 检测。PCR 扩 增的基本 条件：PCR 总反 应体系25 L，其中包括2.5 L 10Taq 酶 缓冲液（Tris-HCl，25 mmolL-1 MgCl2，50 mmolL-1 KCl，0.1%Triton X-100，pH 9.0），2.5 L dNTP（10 mmolL-1），20 ng患病 泡桐模板DNA，植原体16 S rRNA通 用引物Primer1（10 molL-1）和 Primer 2（10 molL-1）各0.5 L（Primer1：5-ACGACTGCTAAGACT-GG-3；Primer2：5-GCGGTGTGTACAAACCCCCG-3）；1.25 U Taq DNA 聚合酶。反应体 系在PTC-200基因扩 增仪上 进行。扩增程序为94 预变性3 min；再94 变性1 min，52 退火1.5 min，72 延伸2 min，共30个循环；最后72 延伸10 min。泡桐丛枝 病植原 体16S rRNA检测采 用Nest-PCR进行2轮扩增，两 轮引物 序列分 别是R16mF1：5CAT GCA AGT CGA ACG GA-3，R16mR1：5-CTT AAC CCC AAT CAT CGA-3；R16F2：5-ACG ACT GCT AAG ACT GG-3，R16R2：5-GCG GTG TGT ACA AAC CCC G-3。第一 轮扩增 反应体 系为25 L，10 Taq 酶缓冲液2.5 L,模板DNA 20 ng，0.5 L R16mF1（10 molL-1），0.5 L R16mR1（10 molL-1），2.5L dNTP（10 molL-1），0.25 L Taq DNA 聚 合酶（5 U/L），第二 轮PCR体系同 第一轮，1 L模板DNA（第一轮PCR产物稀释50倍），0.5 L引物R16mF2（10 molL-1），0.5 L引物R16mR2（10 molL-1），其他成 分同 第一轮，反应程序如下：94 预变性3 min；再94 变性1 min；52 退火1 min；72 延伸2 min，扩增5次循 环；94 变性30 s；52 退火1 min；72 延伸2 min；扩增25次循 环；最 后72 再延伸10 min；4 保存。待第 二轮PCR 程序 结束后，取 第二轮 扩增产物2.5 L，在1%琼 脂糖凝 胶（含0.5%EB）上80 V电泳1 h，观察 电泳结 果。如 检测出植 原体16S rRNA特有的1.2 Kb条 带即可 证 明所取的 材料含 有泡桐 丛 枝病植原 体。6 泡桐丛 枝病 植原 体保 存 6.1 泡桐丛 枝病 植原 体苗 继代 培养 当初代培养 苗的芽 生长至3 cm时，从 茎基部 剪下，放入附加不 同植物 生长调 节物质的1/2MS培养基上进 行继代 培养，培 养基中蔗 糖质量 浓度为25 gL-1，琼脂4.5 gL-1。在4.3培养 条件下 生根，培养20d时，可形成 完整 的根系。经 培养获 得的苗 木为第二 代，根据 需要可 依此方法 多次继 代培养，泡桐丛枝 病植原 体可长 期 保存。6.2 继代培 养泡 桐丛 枝病 植原 体的鉴 定 鉴定方法 按5.2规定。7 档案管 理 DB41/T 13762017 4 建立泡桐 丛枝病 植原体 培 养体系档 案，内 容包括：材料来源、培养 过程记 载 资料、实 物材料 及图片资料。档案 应由专 人 负责填写 和保管，并由 业 务领导和 技术人 员审查 签 字，长期 保存。_