ICS 65.020.30 B 43 备案号：56304-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 26912017 明胶中貉源性成分定性检测 实时荧光PCR法 Identification of Raccoon Dog derived materials in gelatin-Real time PCR method 2017-09-30发布 2017-11-30实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 26912017 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中华人民共和国吉林市出入境检验检疫局，虎林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘金华，王岸英，刘婧，聂丹丹，罗雁非，王玮琳，曲辉，吴鑫本。DB22/26912017 1 明胶中貉源性成分定性检测 实时荧光 PCR 法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了明胶中貉源性成分实时荧光PCR检测方法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步骤、试验数据处理。本标准适用于明胶中貉源性成分的实时荧光PCR检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 6783 食品安全国家标准 食品添加剂 明胶 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 25165 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 3 原理 利用实时荧光PCR技术，根据貉物种的特异性基因序列对貉源性成分进行鉴定。利用裂解液破碎细胞，用酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行内参照基因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的提取效率；通过特异性引物和标记荧光物质的探针进行貉源性成分的实时荧光PCR扩增，根据对PCR扩增反应中荧光信号生成扩增曲线的判定，实现对貉源性成分的定性分析。4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。4.1 裂解液:2%CTAB(cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)；100 mmol/L Tris(tris hydroxymethyl aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)；1.4 mol/L NaCl；20 mmol/L EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，用 HCl 调至pH8.0。4.2 2Real-time PCR 预混液。4.3 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。4.4 氯仿。4.5 异戊醇。4.6 无水乙醇。DB22/26912017 2 4.7 异丙醇。4.8 70%乙醇。4.9 哺乳动物特异基因（内参基因）引物和探针 哺乳动物特异基因上游引物：5-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3 哺乳动物特异基因下游引物：5-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3 哺乳动物特异基因探针：5-（FAM）-CGCACACACCGCCCGTCACCC-（TAMRA）-3 4.10 貉特异基因用引物及探针 貉特异基因上游引物：5-CTATACCTGGCATCTGGTTCTTACC-3 貉特异基因下游引物：5-GTCCCATTTGAGTGGATTAGTAGGA-3 貉特异基因探针：5-（FAM)-CAGGGCCATGAACTCCCTCCATCC-(TAMRA)-3 5 仪器和设备 5.1 实时荧光 PCR 仪。5.2 高速冷冻离心机(不少于12 000 r/min)。5.3 涡旋混合器。5.4 分析天平：感量 0.01 g。5.5 微量移液器：0.1 L2.5 L，1L10 L，2 L20 L，10 L100 L，20 L200 L，100 L1000 L。5.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.7 恒温水浴箱或金属浴。6 样品 按照GB 6783对食用明胶采样（5.4），按照GB/T 14699.1对饲料明胶采样，将实验样品粉碎，充分混匀后待用。7 试验步骤 7.1 样品DNA 提取 按GB/T 25165规定的方法对样品进行DNA提取（5.2,5.3,5.5,5.6,5.7）。7.2 实时荧光 PCR 扩增 7.2.1 进行样品检测时，应同时对内参基因及貉特异基因进行扩增，并设立阴性对照、空白对照和阳性对照实验（5.1）。7.2.2 实时荧光 PCR 反应条件随仪器不同略有改变，一般为：95/10 min，1 个循环；95/15 s，60/1 min，45 个循环，在每次循环的 60/1 min 时收集荧光。7.2.3 检测结束后，根据扩增曲线和 Ct 值判定结果。样品设 2 个重复，以 Ct平均值作为最终结果。7.2.4 实时荧光 PCR 反应体系见表 1。表1 实时荧光 PCR 反应体系 DB22/26912017 3 试剂成分 体积 L 2Real-time PCR预混液 10 上游引物（10 mol/L）1 下游引物(10 mol/L）1 探针(10 mol/L）1 模板DNA（1 ng/L 100 ng/L）5 双蒸水 2 8 试验数据处理 8.1 PCR 有效性判定 8.1.1 空白对照为无 FAM 荧光信号，相应 Ct 值40。8.1.2 阴性对照为无 FAM 荧光信号，相应 Ct 值40。8.1.3 阳性对照有 FAM 荧光信号，且 FAM 通道出现明显的扩增曲线，Ct 值36。8.1.4 内参照基因检测 Ct 值应在 2035 之间。8.1.5 否则判定为 PCR 无效。8.2 试验结果 8.2.1 待测样品貉源性基因检测 Ct 值大于或等于 40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出貉源性成分。8.2.2 待测样品貉源性基因检测 Ct 值小于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出貉源性成分。8.2.3 待测样品貉源性基因检测 Ct 值在 3640 之间，应重做实时荧光 PCR 扩增。再次扩增后的结果Ct 值仍小于40 者，且阴性对照和阳性对照结果正常，则可判定该样品检出貉源性成分；再次扩增后结果 Ct 值大于40，且阴性对照和阳性对照结果正常，可判定该样品未检出貉源性成分。_