ICS 65.020.30 B 41 备案号：55651-2017 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1238 2017 绵羊肺腺 瘤病毒双 抗体夹心ELISA 检测 技术 Detection of double antibody sandwich ELISA for envelope protein of jaagsiekte sheep retrovirus(JSRV)2017-09-10 发布 2017-12-10 实施 内 蒙 古 自 治 区 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB15/T 1238 2017 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 缩 略语.1 5 试剂.2 6 材 料与 设备.2 7 样 品前 处理.2 8 操 作方 法.2 9 结 果判 断.3 附 录A（规 范性 附录）试剂配 制目 录.5 DB15/T 1238 2017 II 前 言 本标 准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由内 蒙古 质量 技术 监督局 提出 并归 口。本标准 主要 起草 单位：内 蒙古农 业大 学。本标准 起草 人：刘淑 英、刘月。DB15/T 1238 2017 1 绵 羊肺腺 瘤病毒双 抗体夹 心 ELISA 检 测技术 1 范围 本标准 规定 绵羊 肺腺 瘤病 毒 双抗 体夹 心ELISA 检测 技术的 试剂、材料 与设 备、样 品前 处理、操作 方法、结 果判 定等。本 标准 适用 于内 蒙古 自治区 检测 临床 疑似 病羊、进出境 种羊 外周 血液 样品 中绵羊 肺腺 瘤病 毒囊 膜蛋白，和 羊临 床样 品中 绵羊 肺腺瘤 病病 原的 快速 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少 的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 术语 和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 绵羊肺 腺瘤 病毒 Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV 绵羊肺 腺瘤 病毒（JSRV）是引起 绵羊 肺腺 瘤 病（OPA）的病 原。该病 毒 属 单股 正链 RNA 逆 转录 病毒，其 病毒 的 囊 膜蛋 白 是 具有 转化细 胞 和 致癌 功能 的蛋 白质，位于 病毒 粒子 的最 外层，是构 成病 毒粒 子 的 主要结构 蛋白。3.2 双 抗体 夹 心ELISA 技术 double antibody sandwich ELISA 指 特 异 性抗 体 结合 到 固相载 体 上 形成 固 相抗 体，然后 和 待 检血 清 中的 相 应抗原 结 合 形成 免 疫复 合物，洗 涤后 再加 酶标 抗体，与免疫 复合 物中 抗原 结合 形成酶 标抗 体 抗原 固 相抗体 复合 物显 色 来 检测抗原含 量 的 技术。4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件：a)JSRV：绵羊 肺腺 瘤病 毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）；b)exJSRV：外 源性 绵羊 肺腺 瘤病毒(exogenous jaagsiekte sheep retrovirus，exJSRV)；c)enJSRV：内 源性 绵羊 肺腺 瘤病毒（endogenous jaagsiekte sheep retrovirus，enJSRV）；d)OPA：绵羊 肺腺 瘤病（ovine pulmonary adenomatosis，OPA）；DB15/T 1238 2017 2 e)ELISA：酶 联免 疫吸 附测 定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）；f)PBS：抗体 样品 稀释 液(磷 酸盐缓 冲液,Phosphate Buffered Saline，PBS）；g)PBST：洗涤 液(PBS+Tween-20，PBST)；h)HRP：辣根 过氧 化物 酶（hydrogen-peroxide oxidoreductase，HRP）。5 试剂 5.1 除非另 有说 明，在检 测中 使用的 化学 试剂 均为 分析 纯，实 验室 用水 应符 合GB/T 6682 中 三级 水的要求。5.2 红 细 胞 裂 解 液（配制见附 录 A 中A.1）。5.3 抗体样 品稀 释液（配 制见 附录 A 中A.2）。5.4 包被缓 冲液（配 制见 附 录A 中A.3）。5.5 包被抗 体（配制 见附 录 A 中A.4）。5.6 检测抗 体（配制 见附 录 A 中A.5）。5.7 洗涤液（配 制见 附 录A 中A.6）。5.8 封闭液（配 制见 附 录A 中A.7）。5.9 TMB 底 物显 色液（配 制见 附录 A 中A.8）。5.10 底物终 止 液2M H2SO4（配 制见附 录 A 中 A.9）。6 材料与 设备 6.1 微量加 样器。量 程分 别 0.2 L2 L、1 L 10 L、10 L 100 L、20 L 200 L 和 100 L 1000 L 的 移液 器，并配 备与移 液器 相匹 配的 吸头。6.2 4-20 冰箱。6.3 电热恒 温培 养箱。6.4 96 孔 酶标 板。6.5 自动酶 标检 测仪。6.6 旋涡振 荡器。7 样品前 处理 取新鲜 抗凝 血5 mL，3000 r/min 离心15 min，弃上 清，按1:5 的 比例 向细 胞沉 淀中加 入冰 箱预 冷 的红细胞 裂解 液混 匀，4 静置10 min，期间 上下 颠 倒混匀5次，1000 r/min 离心5 min，离心 弃去 上层 红色液体，收集 沉淀 部分。如果沉 淀还有 红色，可重 新加入 红细胞 裂解 液，重 复1遍；向沉 淀中加 入样 品稀释液200 L，反 复冻 融 或室温 静置1 h 使细 胞破 裂，期间 不时 在旋 涡振 荡器 上混合；1000 r/min离心5 min，取 上清 液进 行检 测。8 操作方 法 8.1 包被 ELISA 板每 孔 加100 L 包 被缓冲 液稀 释过 的包 被抗 体（浓度约 0.0386 mg/mL），4 下过 夜包 被。DB15/T 1238 2017 3 8.2 洗涤 用滤纸 拍干，用PBST 液洗 板5次。8.3 封闭 ELISA 板每 孔加 入封 闭液200 L，37 下孵 育1 h。8.4 洗涤 用滤纸 拍干，用PBST 液洗 板5次。8.5 加待检 样品 ELISA 板 每孔 加待 检 样品 100 L，37 下孵 育 1 h。加 入阳 性对 照，阴 性对照 和 PBS 空 白对 照。注：阳性对照是鉴定为自然感染JSRV 病毒的绵羊肺腺瘤病肺组织提取蛋白，阴性对照为未感染绵羊肺腺瘤病的绵羊健康肺组织提取蛋白.8.6 洗涤 用滤 纸 拍干，用PBST 液洗板5次。8.7 加酶标 抗体 ELISA 板每 孔加 稀释 过的 酶标抗 体 100 L（浓度 约为 0.0116 mg/mL），37 下孵 育1 h。8.8 洗涤 用滤纸 拍干，用PBST 液洗 板5次。8.9 显色 ELISA 板每 孔加TMB 显 色液100 L，避光15 min 30 min。8.10 终止 ELISA 板每 孔加 终止 液100 L。8.11 读值 终止反 应后 将ELISA 板置 于 自动酶 标仪 上，在450 nm 波长下 读取 光吸 收OD 值。9 结果判 断 9.1 结果分 析条 件设 定 阳性 对照 平均OD 值 与阴 性对照 平 均 OD 值的 比值 大 于 2.1，空 白对 照平 均OD 值小于 或等 于阴 性对照平 均OD 值，检测 结果 有 效。否 则应 检查 实验 操作 并进行 重测。9.2 阳性判 定标 准 被检样 品 OD 值 与阴 性对 照 平均 OD 值 的比 值大 于等 于 2.1 判定 为阳 性。DB15/T 1238 2017 4 9.3 阴性判 定标 准 被检 样品OD 值 与阴 性对照 平 均 OD 值的 比值 小 于2.1 判定 为阴 性。DB15/T 1238 2017 5 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂配 制目 录 A.1 红细胞 裂解 液 NH4CL 8.29 g，KHCO3 1.00 g，Na2EDTA 37.2 mg 溶于1000 mL 蒸馏 水，调pH 至7.4。A.2 抗体样 品稀 释液 NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.27 g，Na2HPO4 1.42 g，KCl 0.2 g 溶于1000 mL 蒸 馏 水，调pH 至 7.4。A.3 包被缓 冲液 Na2CO3 1.599 g，NaHCO3 2.939 g，溶解 于800 mL 去 离 子水中，调 节pH 至9.6，定 容到l L,4 保存备用。A.4 包被抗 体 JSRV 囊 膜蛋 白抗 原表 位富 集区段 的蛋 白作 为抗 原，按常规 方法 免疫 新西 兰白 兔，制 备包 被抗 体。A.5 酶标抗 体 JSRV 囊 膜蛋白 抗原 表位特 异区段 的蛋白 作为 抗原，按常规 方法免 疫小 鼠，制 备检测 抗体。用HRP 标记试剂 盒标 记检 测抗 体，制备酶 标抗 体。A.6 洗涤液 1L PBS 溶液 加入0.5 mL吐温20（Tween-20）室 温保 存。A.7 封闭液 含10%脱脂 乳的PBST 溶液。A.8 TMB 底 物显 色液 底物显 色A 液：醋酸 钠13.6 g，柠 檬酸1.6 g，H2O2（30%）0.3 mL，dH2O 500 mL。底物 显色B液（避光保存）：EDTA-Na 0.2 g，柠檬酸0.95 g，甘 油50 mL，TMB(四甲 基联 苯胺)0.2 g 用DMSO 溶 解为10 mg/mL后 再加dH2O 500 mL，使用时A液和B液 等体 积混 匀。DB15/T 1238 2017 6 A.9 底物终 止液 取2 mol/L H2SO4 22.2 mL 缓缓加 入到177.8 mL 去 离 子水中。_