ICS 67.120 B 45 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 26002016 梅花鹿、马鹿茸片鉴别方法 PCR法 Identification of Sika Deer and Wapiti Velvet SlicesPolymerase Chain Reaction Method 2016-12-22发布 2017-04-01实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 26002016 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：杨颖、邢秀梅、荣敏、刘敏、武薇、吴琼、徐超、徐佳萍、涂剑锋、刘汇涛、刘华淼。DB22/T 26002016 1 梅花鹿、马鹿茸片鉴定方法 PCR 法 1 范围 本标准规定了梅花鹿、马鹿茸片的PCR鉴定方法的原理、试剂或材料、仪器设备、试验步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施。本标准适用于梅花鹿、马鹿茸片产品的真伪鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 鹿茸片 deer velvet slices 为梅花鹿和马鹿的商品茸利用特制的切具切制的薄片。4 原理 利用梅花鹿、马鹿线粒体DNA（mtDNA）的D-loop区特异性基因序列设计引物，应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增特异性DNA片段，依据是否扩增出特异性片段对鹿茸片进行鉴定。5 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1 水，GB/T 6882，一级。5.2 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。5.3 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。5.4 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。5.5 十二烷基硫酸钠（SDS）。5.6 氯化钠。5.7 三氯甲烷。5.8 异丙醇。5.9 无水乙醇。DB22/T 26002016 2 5.10 70%乙醇。5.11 CTAB 提取缓冲液：20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2EDTA,pH8.0。5.12 CTAB 沉淀液：5 g/LCTAB，40 mmol/L NaCl。5.13 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）。5.14 NaCl 溶液（1.2 mol/L）。5.15 TE 缓冲液（Tris-Cl、EDTA 缓冲液）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,1 mmol/L EDTA（pH8.0）。5.16 引物 DF 5，-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3，DR 5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3，6 仪器设备 6.1 PCR 仪。6.2 紫外分光光度计或核酸蛋白分析仪。6.3 电泳仪。6.4 凝胶成像系统。6.5 电子天平：感量 0.0001 g。6.6 离心机：离心力12 000 rpm。6.7 涡旋振荡器。6.8 恒温水浴锅。6.9 研钵或粉碎装置。6.10 微量移液器：0.5 l10 l，10 l100 l，20 l200 l，200 l1000 l。7 试验步骤 7.1 样品制备 将样品用研钵或粉碎装置研磨成粉末状即可。7.2 DNA 提取 7.2.1 将样品研磨后，称取 200 mg 左右样品于 2 mL 离心管中，加入 1.5 mL CTAB提取缓冲液和 40 L蛋白酶 K 溶液。7.2.2 60 震荡过夜后 13000 g 离心10 min，转移上清液到新的离心管中。7.2.3 加入750 L三氯甲烷后用力震荡，13000 g 离心5 min，将上清液转移到新的离心管中。7.2.4 加入 2 倍体积的 CTAB 沉淀溶液，室温静置 60 min，13000 g离心 15 min，弃去上清液。7.2.5 加入 350 L NaCL 溶液将沉淀进行悬浮。再加入 350 L 三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13000 g 离心10 min。7.2.6 转移上清液后加入 0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置 20 min，13000 g离心 10 min，弃去上清液。7.2.7 加入500 L75%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 200 L 超纯水中。立即使用或-20保存备用。7.2.8 也可用等效的 DNA 提取方法提取模板 DNA。7.3 DNA 质量的测定 DB22/T 26002016 3 使用紫外分光光度计或核酸蛋白分析仪，分别测定260nm和280nm处吸光值（OD）为A260和A280，DNA浓度按公式（1）计算。当A260/A280比值在1.61.8之间，适宜PCR扩增。100050=N AC.(1)式中：CDNA浓度，为微克每微升（g/l）；A260 nm处的吸光值；N 核酸稀释倍数。7.4 PCR 反应体系 PCR反应体系见表1，同时设置阴性对照（超纯水）。表1 PCR 反应体系（15 l）反应试剂 反应体积 l ddH2O 9.3 10 Buffer 1.5 dNTPs 2.0 引物 各0.5 Taq酶 0.2 DNA模板 1.0 7.5 PCR 反应程序 预变性94 C，5 min；循环扩增94 C，30 s，56 C/30 s，67 C，1 min，30个循环；延伸67 C，5 min。7.6 PCR 扩增产物电泳 用1TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度0.5%ug/ml）。将平板放入水平电泳槽中，加入1TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增6 ul与1 ul上样缓冲液混合，分别加入样品孔中，取5 ul DNA Marker DL 2000加入到标准分子量对照孔内。5 V/cm恒压电泳30 min45 min。8 结果判定 待检样品扩增出307 bp或306 bp的特异性片段，即可判定为含有梅花鹿或马鹿鹿茸。必要时取PCR扩增产物进行测序，结果与附录A参考序列比较，序列相似性在95%以上，可进一步确定待测样品结果为阳性。9 废弃物处理和防止污染的措施 9.1 检测过程中防止交叉污染按照 GB/T 27403 规定执行。DB22/T 26002016 4 9.2 检测过程中的废弃物需经 121 高压灭菌处理至少 30 min。DB22/T 26002016 5 A A 附 录 A（资料性附录）梅花鹿、马鹿的特征性序列 A.1 梅花鹿特异扩增片段序列（307bp）：ACAAAGCACGTGATATAACCTTATGTGTTTGTAGTACATAAAATTAATGCATTAAGGCACACATGTACAATGGTACATAAAATCGGTGTATAGGACATATTATGCATAATAGTACATAAATTAATGTATTAGGACATACTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTATTTTCTATTATCTACAGTACATAGTACATGATGTTGCTTATCGTACATAGCGCATTGAGTCAAATCAGTCCTCGTCAGCATGCGTATCCCGTCCACTAGATCACGAGCTTGATCACCATG A.2 马鹿特异扩增片段序列（306bp）：GCAAAACACGTGATATAACCTTATGCGCTTGTAGTACATAAAATCAATGTACTAGGACATGCATGTATAACAGTACATAAGTTAGCGTATAGGACATATTATGTATAATAGTACATAAATTAATGTATCAGGACATATTATGTATAATAGTACATTATATTATATGCCCCATGCTTATAAGCATGTACTTTCTACTATCTAAAGTACATAGTACATAATGTTGTTCATCGTACATAGTACATTAAGTCAAATCAGTCCTTGTCAACATGCGTATCCCGTCCCCTAGATCACGAGCTTAATTACCATG _