ICS 07.100 C 04 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 25652016 流感病毒分离 MDCK细胞法 The isolation and culture method for Influenza virus in MDCK cell 2016-12-09发布 2017-03-01实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 25652016 I 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：李静、柳鸿敏、吴东林、臧希卉。DB22/T 25652016 1 流感病毒分离 MDCK 细胞法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了无血清流感病毒分离MDCK细胞法。本标准适用于无血清流感病毒分离。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 3 生物安全级别和生物安全要求 3.1 生物安全级别 生物安全二级。3.2 生物安全要求 实验人员应穿戴医用防护服、防护鞋、医用防护口罩、工作帽、医用乳胶手套。4 试剂和材料 4.1 无血清 MDCK细胞培养液 4.2 流感病毒分离无血清培养液 4.3 青、链霉素母液：含 10 000 U/mL青霉素 G和 10 000 g/mL硫酸链霉素 4.4 EDTA-胰酶：胰酶浓度为 0.25%，EDTA4Na 浓度为 0.53 mmol/L 4.5 TPCK-胰酶（牛胰腺来源型）：2 mg/mL 4.6 磷酸盐缓冲液（PBS）：0.01mol/L，pH 值为 7.2 4.7 Hanks液：pH 值为 7.27.4 4.8 病毒采样液：内带拭子 4.9 T-25 细胞培养瓶 4.10 无菌移液管：1 mL、10 mL 4.11 无菌离心管：1 mL、10 mL 4.12 乙醇溶液：70%75%乙醇 DB22/T 25652016 2 5 仪器设备 5.1 生物安全柜：CLASS型 5.2 倒置显微镜 5.3 CO2恒温培养箱：35 1 和37 1 5.4 水浴箱：37 1 5.5 冰箱：4 5.6 低温冰箱：-70 5.7 漩涡振荡器 5.8 高压灭菌器 5.9 台式离心机 6 标本 6.1 标本的采集 6.1.1 鼻拭子 将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻颚处，旋转后静止待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。将拭子头浸入病毒采样液（4.8）中，弃去拭子尾部后送检。6.1.2 咽拭子 用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧扁桃体及咽后壁后，将拭子浸入病毒采样液（4.8）中，弃去拭子尾部后送检。6.2 标本的运送和保存 新鲜采集的标本应在0 4 条件下48 h内运送至实验室。未能48 h内送至实验室的，应置低温冰箱（5.6）中保存。6.3 标本处理 用漩涡振荡器（5.7）将标本振荡混匀置4 冰箱（5.5）内待其自然沉淀10 min后，取900 L标本加入含有100 L青、链霉素母液（4.3）的1 mL无菌离心管（4.10）中，置于4 冰箱（5.5）内过夜。7 试验步骤 7.1 准备试剂 7.1.1 无血清 MDCK细胞生长液 500 mL无血清MDCK细胞培养液（4.1）加入5 mL的青、链霉素母液（4.3）。7.1.2 流感病毒生长液 500 mL流感病毒分离无血清培养液（4.2）加入5 mL的青、链霉素母液（4.3）以及0.5 mL TPCK-胰酶（4.5），使TPCK-胰酶终浓度为2 g/mL。DB22/T 25652016 3 7.2 MDCK 细胞的培养 7.2.1 将配好的无血清 MDCK 细胞生长液（7.1.1）、EDTA-胰酶（4.4）和 PBS（4.6）置 37 水浴预热 15 min，瓶体外用 70%75%乙醇擦拭后放于生物安全柜内。7.2.2 选择 80%90%生长融合的MDCK 细胞，弃去细胞培养瓶中的培养液，用 10 mL 无菌移液管吸取 6 mL PBS 清洗细胞三次。7.2.3 加入 1 mL 37 预热的 EDTA-胰酶，轻轻地晃动细胞瓶，使 EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。7.2.4 将细胞瓶置于 37，5%CO2恒温培养箱内孵育（约 5 min10 min），至细胞收缩变圆从细胞瓶内壁分离。7.2.5 加 5 mL 无血清 MDCK 细胞生长液（7.1.1）终止消化，用无菌移液管将细胞团轻轻吹散。7.2.6 细胞悬液转入离心管中，800 rpm 离心 5 min，去除上清液，重新加入无血清 MDCK 细胞生长液（7.1.1）悬起细胞（细胞悬液的浓度约为每 mL含 105细胞）。7.2.7 每个 T-25 细胞培养瓶中加 6 mL（6105/mL 细胞）细胞悬液，置于 37 5%CO2恒温培养箱中，每天观察细胞状态。23 日可长成80%90%融合的单层细胞。7.3 流感病毒 MDCK 细胞分离 7.3.1 将配好的流感病毒生长液（7.1.2）和 Hanks（4.7）液置 37 水浴预热15 min 后，瓶体外用 70%75%乙醇擦拭后放于生物安全柜内。7.3.2 倒置显微镜 40 倍物镜观察，选择 75%90%生长融合的处于对数生长期的 MDCK 细胞用于流感病毒的分离培养。7.3.3 轻轻倒出细胞生长液，用 10 mL 无菌移液管吸取 6 mL Hanks 清洗MDCK 细胞，反复 3 次。7.3.4 吸取 200 L处理过的标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。7.3.5 将培养瓶放入 35，5%CO2恒温培养箱中孵育 12 h。7.3.6 吸出接种液体，用 6 mL Hanks 清洗细胞，反复 2 次，然后加入 6 mL 流感病毒生长液于细胞培养瓶中。7.3.7 放置于 35，5%CO2恒温培养箱中，每日观察细胞病变情况。7.4 细胞培养物的收获 当75%100%细胞出现病变（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大成网状，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）时进行收获。即使无细胞病变也应该于第7天收获。8 质量保证和控制 8.1 MDCK 细胞系的敏感性检测 在过量传代的情况下，MDCK细胞可能会失去其对流感病毒的敏感性。实验室应在液氮中保存低代数的细胞株。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传代1520代，或细胞达到40代以上时，需进行敏感性测定。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。8.2 设置阴阳性对照 选择已知的流感病毒阳性毒株或阳性标本作为阳性对照，选择阴性标本或者磷酸盐缓冲液作为阴性对照。DB22/T 25652016 4 9 菌（毒）种的保存及管理 分离得到的流感病毒毒株，应置于菌（毒）种库中-70 或以下条件保存。应实行双人双锁管理，做好相关菌（毒）种保存和使用登记。10 结果判读 进行红细胞凝集试验（HA），HA 8时用红细胞凝集抑制试验（HI）方法进行流感病毒的鉴定。如没有红细胞凝集现象，应继续盲传1 次2 次。HA试验仍为阴性者，认为MDCK细胞病毒分离阴性。对于HA8的细胞分离物继续进行细胞传代，直至HA 8时才能利用HI方法进行流感病毒的鉴定。经连续传代2次以上，HA8者，可以用流感病毒核酸检测方法鉴定分型。11 废弃物处理及防治污染的措施 11.1 检测过程中的废弃物经 121 高压灭菌 30 min 后再弃置。11.2 废弃物处置应按照 GB 19489-2008中7.19 项的有关规定执行。11.3 为了保护实验室人员安全，应由具备资格的工作人员进行废弃物处理。_